请哪位大侠帮我解决一下5'RACE引物的设计问题（TAKARA试剂盒）
丁香园论坛
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大侠，你好，我是一位涉世不深者，用TAKARA公司的3'RACE试剂盒刚克隆完3'RACE的序列，大概1000bp，现在想同样用5'RACE的试剂盒把5'末端做出来，但是因为TAKARA的试剂盒要设计5条引物，一条反转录引物，两对PCR引物，我觉得有点难，请哪位大侠告诉我设计这几条引物应该注意什么，该如何设计，我把序列也贴出来，希望哪位大侠帮帮忙，有时间帮我分析一下这段序列，当然如果帮我设计这5条引物来，小生真是不甚感激。
AACAATCCTGTAAGCGGCACAAACCTTTGCTACTCCTTACACTTCTACGCGGCAACTCATAAACAAAACTTAAGAGACAAGGCGCAGGCTGCAATAAATAAGGGAGCTTGTATCTTCGTAACTGAATACGGAACCGTTGATGCAAGTGGAGGTGGTGGAGTGGATGAAGGCTCAACAAAAGAATGGTATAACTTCTTGGATAGTAACAAGATTTCTAACCTCAACTGGGCTATCTCAAACAAGGCGGAAGGTGCTTCAGCACTCACATCTGGAACGAGTGCTTCTCAAGTTGGCAATGATGACCGACTGACTGCCTCCGGTCTTATAGTGAAGAAGTATATTAAATCAAAAAATACCGGTGTCAGTTGCAGTGGTGCATCGTCAAGCAGTGGTTCAGGAAGTAAACCCTCAGGAAATAAACCGAGCAACTCAGAAAGCAGCACTGCCAAGACATCAGGCAATTCAGGAAATAAAGGCGGTAATTCTAACACAGGGAGTAATGCAAATAACTCAGGAAGTAAATCGGGCAACTCCGGAAGTAATACAGGAAACACGGGCAGCAATGCTGGGGCCAATTCAGGAAATACGGGAACCAGTACAGGCAGTAGTTCTGTTACAGCTTCAGTGCAAGTTCCCGATAAATGGGATAATGGCGCAAGATTCCAGTTAGTATTTAAAAACAATGCAAGTACAAAAAAGTGTGGAGTGAAATTTTCATTGACTTTTGCCTCTGGACAACAAATTACTGGCATTTGGAATGTCCAAAATGTAACAGGAAATAATTTTGTTCTTCCAGACTACGTTACAATTGAGGCGGGGAAACAATATACAGATGCAGGAATGAATATAAATGGGCCAGCAACTCCTCCACAAATTAAAGTGCTCGGCGATGGAAAATGCGTTCATTGAAATTAGAAGAGATGATTGTTGAACCATTTAATATTGTGATTGTTTAAATTGTCAATATGAATTTATGTATATGTTGCTTCAAATAATGTTGTTTATGTTTTATTGATAAATTTTTGTATTGTAAAAAAAAAAAAAGTCGTGACTGGGAAAAC
我自己也试着设计了一次引物，帮忙分析一下，是否合适。
5’RACE引物：
RT-primer:
5’-ACTTGCATCAACG-3’ （约存在于序列的148-135bp）
PCR1引物：
A1:5’-CGTAGAAGTGTAAGGAGTAG-3’ （约存在于30-50135bp）
S1:5’-AGAGACAAGGCGCAGGCTGC-3’ （约存在于73-93bp）
PCR2引物：
A2:5’-TTGTGCCGCTTACAGGATTG-3’ （约存在于23-3bp）
S2:5’-GCTTGTATCTTCGTAACTGA-3’ （约存在于106-126bp）
AACAATCCTGTAAGCGGCACAAACCTTTGCTACTCCTTACACTTCTACGCGGCAACTCATAAACAAAACTTAAGAGACAAGGCGCAGGCTGCAATAAATAAGGGAGCTTGTATCTTCGTAACTGAATACGGAACCGTTGATGCAAGTGGAGGTGGTGGAGTGGATGAAGGCTCAACAAAAGAATGGTATAACTTCTTGGATAGTAACAAGATTTCTAACCTCAACTGGGCTATCTCAAACAAGGCGGAAGGTGCTTCAGCACTCACATCTGGAACGAGTGCTTCTCAAGTTGGCAATGATGACCGACTGACTGCCTCCGGTCTTATAGTGAAGAAGTATATTAAATCAAAAAATACCGGTGTCAGTTGCAGTGGTGCATCGTCAAGCAGTGGTTCAGGAAGTAAACCCTCAGGAAATAAACCGAGCAACTCAGAAAGCAGCACTGCCAAGACATCAGGCAATTCAGGAAATAAAGGCGGTAATTCTAACACAGGGAGTAATGCAAATAACTCAGGAAGTAAATCGGGCAACTCCGGAAGTAATACAGGAAACACGGGCAGCAATGCTGGGGCCAATTCAGGAAATACGGGAACCAGTACAGGCAGTAGTTCTGTTACAGCTTCAGTGCAAGTTCCCGATAAATGGGATAATGGCGCAAGATTCCAGTTAGTATTTAAAAACAATGCAAGTACAAAAAAGTGTGGAGTGAAATTTTCATTGACTTTTGCCTCTGGACAACAAATTACTGGCATTTGGAATGTCCAAAATGTAACAGGAAATAATTTTGTTCTTCCAGACTACGTTACAATTGAGGCGGGGAAACAATATACAGATGCAGGAATGAATATAAATGGGCCAGCAACTCCTCCACAAATTAAAGTGCTCGGCGATGGAAAATGCGTTCATTGAAATTAGAAGAGATGATTGTTGAACCATTTAATATTGTGATTGTTTAAATTGTCAATATGAATTTATGTATATGTTGCTTCAAATAATGTTGTTTATGTTTTATTGATAAATTTTTGTATTGTAAAAAAAAAAAAAGTCGTGACTGGGAAAAC
我自己也试着设计了一次引物，帮忙分析一下，是否合适。
5’RACE引物：
RT-primer:
5’-ACTTGCATCAACG-3’ （约存在于序列的148-135bp）
PCR1引物：
A1:5’-CGTAGAAGTGTAAGGAGTAG-3’ （约存在于30-50135bp）
S1:5’-AGAGACAAGGCGCAGGCTGC-3’ （约存在于73-93bp）
PCR2引物：
A2:5’-TTGTGCCGCTTACAGGATTG-3’ （约存在于23-3bp）
S2:5’-GCTTGTATCTTCGTAACTGA-3’ （约存在于106-126bp）
