更快速、更智能的CAR-T细胞表型及功能分析
德国赛多利斯集团
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CAR-T
基于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，是一种基因修饰的细胞疗法，是指利用工程T细胞来对抗癌症，正如基因治疗或再生医学一样，是一项可永久改变医学格局的变革性技术。基于CAR-T细胞的疗法使用来自患者自身或异体供体的免疫细胞，经过基因转化，然后输入患者体内，与癌细胞结合并将其破坏。
- 分离循环T细胞
- 在特定肿瘤细胞模型中进行早期体外实验，了解免疫细胞活化
- 运用成像技术和流式细胞术来评估生物反应
今天我们就来讲讲流式细胞术在CAR-T细胞表型及功能评估方面的应用。
赛多利斯iQue®高通量流式细胞仪作为一种高效、便捷、多参数的定量细胞分析工具，为检测CAR-T细胞的扩增和持久性、以及治疗反应提供解决方案。
高效的多重性分析
独特的编码技术使iQue®3能够对单个孔中的多个类型的细胞同时进行多重分析评估，比如同时分析增殖、细胞因子分泌和亚型群体变化（免疫表型）等参数，是研究人员深入研究免疫系统复杂性（例如信号分子和细胞功能变化）的理想平台。
智能的可视化集成软件
Forecyt®软件能够通过生成可视化的微孔板热图、直方图、图表、剂量反应曲线和剖面图来生成指导效下一步操作的可靠数据，可对数据自动比较、识别及排序，避免人工处理数据的时间及精力耗费。
1. 人外周血单核细胞（PBMCs）中细胞因子的高通量分析[1]
背景：免疫功能涉及一套协调的分泌性蛋白，其信号的调节取决于细胞因子依赖性的细胞间的交流，也是药物开发的重要依据之一。分泌蛋白的分析最好是通过同时检测多种蛋白来实现，因为可以最大限度地提高数据的背景和相关价值。而传统ELISA“单端点”读数模式存在一定局限性，而基于微珠的ELISA又涉及多个清洗步骤，限制自动化分析能力，耗时费力。
方案：此案例中我们介绍一个使用iQue®3和Multicyt® Qbeads Plexscreen试剂盒分析PBMCs中细胞因子分泌的案例。实验将来自单一供体的冻存PBMC 进行解冻，并在384 孔板上用已知的三种不同T细胞刺激剂处理，并直接从上清液中监测和定量分析细胞因子分泌情况。此案例中实现免清洗、高通量、自动化的多重性分泌蛋白分析。
图1. 使用Qbeads 显示三种不同PBMC 刺激方法的不同细胞因子图谱
总结：在iQue®可实现的分析小型化能对PBMC刺激的剂量反应进行高性价比筛选，提供准确的指导性结果，因此无需耗费时间进行剂量探索实验。Multicyt® Qbeads通过提供一个简化的、多重的工作流程，将分泌蛋白的筛选提升到一个更高级的水平，可大幅降低成本。
2. 筛选能提高记忆型T细胞出现频率的体外条件[2]
背景：T 细胞的体外扩增是过继细胞疗法（如 CAR-T和TIL肿瘤浸润淋巴细胞）生产工艺的关键步骤。近期临床研究表明，功能记忆T细胞亚群，包括干细胞样记忆T细胞(Tscm)、中央记忆T细胞(Tcm)和其他分化程度较低的T细胞亚群之间具有某种相关性，这是患者产生长期抗肿瘤反应的原因。这表明体外T细胞扩增过程中，让T细胞产物中产生更高比例的Tscm和Tcm对于细胞治疗的显著临床改善至关重要。而传统方法需要在不同平台上运行多个分析过程才能确认不同种类细胞的各项关键参数，效率低下且消耗样品量高。
方案：此案例中我们展示了使用iQue®以及人T细胞记忆细胞与细胞因子分析试剂盒(TCA)的多重性分析功能在T细胞表型和功能分析监测中的应用。TCA包含用于识别T细胞和识别初始Tscm、Tcm和TEFF的抗体标记物。此外，通过同时进行IFN和IL-10分泌情况的定量分析和表型分析来进行细胞功能分析。实验中使用来自三个供体的人外周血单核细胞(PBMC)，并在14 种不同的培养条件下进行筛选研究。多重性筛选大大提高了筛选效率。
图2. 在添加细胞因子的培养基中进行体外扩增后，记忆型T细胞频率增加
总结：培养基添加剂对最终的T记忆亚群、细胞组成和细胞因子释放产生重要影响。TCA试剂盒简便的分析方法可整合于T细胞疗法工作流程，在单一的检测中进行多重细胞和分泌细胞因子的检测。可在不同阶段对记忆型T细胞表型和功能进行空间和时间分析，所有分析均采用单一的高内涵、小型化分析，可节省宝贵的样品，降低试剂成本，增强数据完整性。
3. 用于激酶抑制剂表型筛选的多重T细胞活化试验 [3]
背景：T细胞受体（TCR）通路在新生和效应T细胞中的激活导致了T细胞的激活、增殖和细胞因子的产生。自身免疫性疾病的主要病因之一就是免疫紊乱导致的高反应性TCR信号增加和T细胞活化增强。许多治疗领域都会使用生物制剂、小分子或基因工程技术来调节TCR的参与和信号通路（包括癌症免疫治疗、细胞疗法和疫苗开发等）。 调节TCR活性的药物和疗法的开发需要分析T细胞功能和健康状况。
方案：此案例中使用iQue®和TCA试剂盒对影响T细胞活化的小分子进行深入而全面的表型筛选。实验中使用Forecyt®软件分析数据并生成热图、IC50曲线和细胞因子水平。使用Profile Maps将自定义的多个分析指标的多重标准整合快速定位靶点。
图3. 抑制CD69 表达的化合物
总结：TCA试剂盒可用作生物制剂和小分子的初级或次级表型筛选。此外，TCA试剂盒可用于肿瘤免疫学领域的功能研究和细胞生产过程中的T细胞表征。适用于许多功能分析的工作流程，包括免疫检查点抑制剂和细胞疗法的开发以及细胞生产过程。
-参考文献-
Narang, R., et al. Application of Multicyt Qbeads for High Throughput Cytokine Proling in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Sartorius Application Note, 2014.
Liu, Z., et al. An Optimized, Multiplexed Assay for Screening Ex Vivo Conditions which Increase Memory T Cell Frequency. Sartorius Application Note, 2019.
Liu. Z., et al. A kinase inhibitor phenotypic screen using a novel multiplex T cell activation assay. Sartorius Application Note, 2019.
基于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，是一种基因修饰的细胞疗法，是指利用工程T细胞来对抗癌症，正如基因治疗或再生医学一样，是一项可永久改变医学格局的变革性技术。基于CAR-T细胞的疗法使用来自患者自身或异体供体的免疫细胞，经过基因转化，然后输入患者体内，与癌细胞结合并将其破坏。
CAR-T 疗法的工作原理
CAR-T疗法的发现和开发过程分为多个步骤，包括：- 分离循环T细胞
- 在特定肿瘤细胞模型中进行早期体外实验，了解免疫细胞活化
- 运用成像技术和流式细胞术来评估生物反应
今天我们就来讲讲流式细胞术在CAR-T细胞表型及功能评估方面的应用。
技术优势
快速、微量、高通量采样技术
样本以气泡分隔的形式被传送到检测器中，因此可同时处理整板数据。仅需不到10 μL样品， 5分钟处理96孔板， 20分钟内即可完成384孔板检测，节约分析时间及宝贵样品。
快速、微量、高通量采样技术
高效的多重性分析
智能的可视化集成软件
干货应用，提前预览
1. 人外周血单核细胞（PBMCs）中细胞因子的高通量分析[1]
背景：免疫功能涉及一套协调的分泌性蛋白，其信号的调节取决于细胞因子依赖性的细胞间的交流，也是药物开发的重要依据之一。分泌蛋白的分析最好是通过同时检测多种蛋白来实现，因为可以最大限度地提高数据的背景和相关价值。而传统ELISA“单端点”读数模式存在一定局限性，而基于微珠的ELISA又涉及多个清洗步骤，限制自动化分析能力，耗时费力。
方案：此案例中我们介绍一个使用iQue®3和Multicyt® Qbeads Plexscreen试剂盒分析PBMCs中细胞因子分泌的案例。实验将来自单一供体的冻存PBMC 进行解冻，并在384 孔板上用已知的三种不同T细胞刺激剂处理，并直接从上清液中监测和定量分析细胞因子分泌情况。此案例中实现免清洗、高通量、自动化的多重性分泌蛋白分析。
总结：在iQue®可实现的分析小型化能对PBMC刺激的剂量反应进行高性价比筛选，提供准确的指导性结果，因此无需耗费时间进行剂量探索实验。Multicyt® Qbeads通过提供一个简化的、多重的工作流程，将分泌蛋白的筛选提升到一个更高级的水平，可大幅降低成本。
2. 筛选能提高记忆型T细胞出现频率的体外条件[2]
背景：T 细胞的体外扩增是过继细胞疗法（如 CAR-T和TIL肿瘤浸润淋巴细胞）生产工艺的关键步骤。近期临床研究表明，功能记忆T细胞亚群，包括干细胞样记忆T细胞(Tscm)、中央记忆T细胞(Tcm)和其他分化程度较低的T细胞亚群之间具有某种相关性，这是患者产生长期抗肿瘤反应的原因。这表明体外T细胞扩增过程中，让T细胞产物中产生更高比例的Tscm和Tcm对于细胞治疗的显著临床改善至关重要。而传统方法需要在不同平台上运行多个分析过程才能确认不同种类细胞的各项关键参数，效率低下且消耗样品量高。
方案：此案例中我们展示了使用iQue®以及人T细胞记忆细胞与细胞因子分析试剂盒(TCA)的多重性分析功能在T细胞表型和功能分析监测中的应用。TCA包含用于识别T细胞和识别初始Tscm、Tcm和TEFF的抗体标记物。此外，通过同时进行IFN和IL-10分泌情况的定量分析和表型分析来进行细胞功能分析。实验中使用来自三个供体的人外周血单核细胞(PBMC)，并在14 种不同的培养条件下进行筛选研究。多重性筛选大大提高了筛选效率。
总结：培养基添加剂对最终的T记忆亚群、细胞组成和细胞因子释放产生重要影响。TCA试剂盒简便的分析方法可整合于T细胞疗法工作流程，在单一的检测中进行多重细胞和分泌细胞因子的检测。可在不同阶段对记忆型T细胞表型和功能进行空间和时间分析，所有分析均采用单一的高内涵、小型化分析，可节省宝贵的样品，降低试剂成本，增强数据完整性。
3. 用于激酶抑制剂表型筛选的多重T细胞活化试验 [3]
背景：T细胞受体（TCR）通路在新生和效应T细胞中的激活导致了T细胞的激活、增殖和细胞因子的产生。自身免疫性疾病的主要病因之一就是免疫紊乱导致的高反应性TCR信号增加和T细胞活化增强。许多治疗领域都会使用生物制剂、小分子或基因工程技术来调节TCR的参与和信号通路（包括癌症免疫治疗、细胞疗法和疫苗开发等）。 调节TCR活性的药物和疗法的开发需要分析T细胞功能和健康状况。
方案：此案例中使用iQue®和TCA试剂盒对影响T细胞活化的小分子进行深入而全面的表型筛选。实验中使用Forecyt®软件分析数据并生成热图、IC50曲线和细胞因子水平。使用Profile Maps将自定义的多个分析指标的多重标准整合快速定位靶点。
总结：TCA试剂盒可用作生物制剂和小分子的初级或次级表型筛选。此外，TCA试剂盒可用于肿瘤免疫学领域的功能研究和细胞生产过程中的T细胞表征。适用于许多功能分析的工作流程，包括免疫检查点抑制剂和细胞疗法的开发以及细胞生产过程。
-参考文献-
Narang, R., et al. Application of Multicyt Qbeads for High Throughput Cytokine Proling in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Sartorius Application Note, 2014.
Liu, Z., et al. An Optimized, Multiplexed Assay for Screening Ex Vivo Conditions which Increase Memory T Cell Frequency. Sartorius Application Note, 2019.
Liu. Z., et al. A kinase inhibitor phenotypic screen using a novel multiplex T cell activation assay. Sartorius Application Note, 2019.
