2012年PCR技术盘点：目标更小 通量更高

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明年是聚合酶链式反应PCR 技术诞生的三十周年，这项技术为生物学，医学研究领域带来了革新性的变化，被广泛的用于传染病诊断，基因复制，遗传疾病鉴定等等方面。

经过多年的发展，PCR 技术越来越完备，虽然其基本程序：变性，退火，延伸并没有发生太大的改变，但是科学家们和技术人员改进了这一方法，也研发出了许多新品种PCR方法，解答了许多此前难以回答的生物学问题。从热稳定的聚合酶，到自动热循环的程序，新的数字PCR(dPCR)方法，再到可应用于高通量PCR的相关微流体设备，没有人认为PCR是一种静态的方法。

许多PCR步骤逐渐被改进，如试剂优化，引物设计优化，产量提高，扩增片段延长，保真度提高，多重反应，定量PCR的发展，这些方面的技术进步极大的拓宽了我们选择性扩增DNA的能力，为许多下游应用提供了更为精确的产物。今天，PCR广泛应用于生态，取证和食品安全 等领域，同时也是分子生物学研究基础实验的重要组成元素。

那么在未来一年里，PCR 技术又会出现哪些方面的进步呢?

目标更小

随着生物学家们展开了针对单细胞分子事件的探索，毫不奇怪PCR 技术也朝着单分子分析方面发展。要做到这一点，反应量就需要大幅度缩减，微流体PCR系统具有精巧设计的通道，以及处理复杂进程的方法，能降低试剂的用量，加速PCR过程，并且所需的样品量也很少。

但要实现更小体积和更快循环速度，是要付出代价的：微流体PCR重复使用过程中出现了PCR效率低，受到污染等问题，降低了反应速度，还有昂贵的制造费用。不过近期的研究成果表明，早期一些错误已经被修改，这一领域在2013年将迎来新的春天。

今年4月，Pak等人发表了一种红外辐射热循环仪，以及相关的微流控芯片，用户只需简单地将芯片加到仪器上，然后在扩增后再取下来。以前的反应系统要求反复校准，热电偶插入(thermocouple insertion)和调整等步骤，省略这些要求，能令实验室中未接受工程培训的研究人员易于进行红外微流体PCR操作(1)。

除此之外，今年其它方面的重要改进也将令微流体PCR在2013年大放异彩，比如半反射(semi-reflective)的发展，在微流体装置通道上覆盖非活性铂纳米颗粒单层，这能增强非接触式温度传感的干涉信号(2)，还有单细胞实时微流控PCR(3)新方法，以及几种新型特异性的，基于微流控的护理诊断试剂。

另外来自美国斯坦福医学院的研究人员还开发出了一种集成微流体电路，用于单细胞实时PCR，而且他们还利用这种设备比较了人类诱导多能干细胞(hiPSCs)和人类多能干细胞(hESCs)的异质性。它们发现相比hESCs在hiPSCs中基因表达水平差异更大，表明一种不稳定的多能状态。此外，研究小组还发现hiPSCs的分化缓慢且不一致，这有可能会不利于其临床应用。

在产品方面，Fluidigm基于其专利的微流体技术，开发了一种全新的单细胞基因表达检测方法，其核心技术在于一种微流体芯片(Integrated Fluidic Circuit, IFC)。这项技术是在1998年由加州理工学院的斯蒂芬•奎克(Stephen Quake)博士领导的研究小组发明的。

当时他们试图寻找一种方法制造能控制极少量液体的微型装置，将其整合成为一个密集的管道系统，从而将成千上万相互独立的生物化学反应集中于一个很小的区域内。最终他们使用一种称为多层软光刻(Multilayer Soft Lithography)的生产过程，应用了一种橡胶类材料，制造出最早的微流体芯片(Unger et al. 113-16)，(Thorsen, Maerkl, and Quake 580-84)。经过进一步完善，目前这项技术已被Fluidigm用于开发出了多种针对不同应用的生物芯片。包括用于单细胞捕获制备的芯片及用于单细胞基因表达的芯片等。

目前单细胞基因表达分析广泛采用了称为BioMark™ HD的微流体PCR系统，这一系统创新技术就在于集成液体通路技术：利用集成电路制作工艺(光刻)在硅片或石英玻璃上刻上许多微管和微腔体，通过不同的控制阀门控制溶液在其中的流动来实现生物样品的分液、混合、PCR扩增。集成流体通路技术极大地简化了生物样品和试剂的分液操作，提高分析通量和灵敏度，其纳升级的反应体系为高通量的基因分析应用节省大量成本(试剂用量更少，样品量更少)。

通量更高

继微流体PCR技术降低了反应量之后，研究人员又开始探索如何能通过dPCR增加通量，和灵敏度。数字PCR（dPCR）设备中的微流控，或液滴平台能达到皮升级的反应量，并且能在一天时间内完成从几十万到上百万的反应。

那么这种技术是如何实现这样高的通量的呢？每个液滴或者反应器中只有一个单模板，或根本没有模板，所以通过筛选阳性反应和阴性反应，就能获得绝对定量，无需标准曲线，这种方法十分合适用于拷贝数变异，罕见序列和突变检测，以及基因表达的研究。

虽然目前dPCR还处于初期发展阶段，但2012年发表的一些研究报告显然证明了这种方法的潜力。研究人员比较了dPCR和qPCR模板定量（4），证明了dPCR在检测特殊污染物，以及疾病标志物方面的潜力，并且利用dPCR细胞也能确保测序文库准备过程中的文库质量（5）。

今年dPCR发展迅猛，在4月份，RainDance Technologies公司推出了一种新型液滴平台，这一平台能进行多重dPCR反应，将每天的反应通量提高到了一亿个反应。在未来的一年里，这种技术还将取得更多的进步。

除此之外，一些公司也纷纷推出了相应的产品，比如曾入选2011年创新产品的QX100微滴式数字PCR系统，这一系统是在传统PCR方法基础上采用一种全新的方式进行核酸分子的定量，与传统PCR、定量PCR相比，其结果的精确度、准确性和灵敏度更佳。

QX100微滴发生器（droplet generator）将含有核酸分子的反应体系形成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子，且每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。经PCR扩增后，采用微滴分析仪（droplet reader）逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。