RT-PCR实验步骤

一、组织抽提：

1. 取组织块50-100㎎用液氮在研钵中研磨成粉末

2. 移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol 抽打匀浆

3. 移入1.5ml新离心管用5 ml针头抽打

4. 冰上孵育5分钟

5. 离心12,000g 4℃ 5分钟 取上清液移入1.5ml新离心管

6. 加0.2 ml氯仿，震荡，冰上孵育5分钟

7. 离心<12,000g 4℃ 10分钟 取上层液相移入1.5ml新离心管

8. 加0.5 ml异丙醇，震荡，冰上孵育5分钟

9. 离心<12,000g 4℃ 5分钟 弃去上清液

10. 加入1 ml 75%乙醇，震荡

11. 离心<7,500g 4℃ 5分钟 弃去上清液

12. 室温下使之变透明

13. 加入DEPC处理水10μl --35μl 溶解RNA（ 可保存在液氮或低温冰箱）

14. 走RNA变性电泳观察18s，28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值，计算RNA浓度

二、RT反应体系（第一步）：约20分钟

RNA 抽提物

5μl

Radome 引物

2μl

RNA sin

0.5μl

1. 65℃ 15分钟

2. 立即放入冰浴

RT反应体系（第二步）：约2小时

RNA sin

0.5μl

10mM  dNTP

1μl

5×RT  缓冲液

4μl

25mM  MgCl2

4μl

AMV  逆转录酶

3μl

1.       37℃ 1.5小时

2.       94℃ 5-10分钟

3.       反应物保存于-20℃或进行PCR

三1、PCR反应体系：约4.5小时

25mM  MgCl2

2μl

10×PCR 缓冲液

5μl

10mM  dNTP

1μl

上下游引物10pmol/μl

2.5μl×2

CDNA模板

2.5μl

ddH2O

34μl

Taq酶

0.5μl

轻质石蜡油

50μl

100μl

1.       94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟 为第一个步1个循环

2.       94℃ 45秒，55℃ 40秒，72℃ 1分钟 为第二步30个循环

3.       72℃ 10分钟

4.       取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳

三2、PCR反应体系：约5小时

25mM  MgCl2

3μl

10×PCR 缓冲液

5μl

10mM  dNTP

1μl

上下游引物10pmol/μl

2.5μl×2

CDNA模板

5μl

ddH2O

30μl

Taq酶

1μl

轻质石蜡油

50μl

100μl

1.       94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟 为第一个步1个循环

2.       94℃ 45秒，50℃ 40秒，72℃ 1分钟 为第二步40个循环

3.       72℃ 10分钟

4.       取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳

四、电泳：约1.25小时

1.       配0.5×TBE电泳缓冲液300 ml

2.       胶浓度1.7%（40ml 0.5×TBE加0.68g胶）

3.       微波炉中火2分钟溶解胶

4.       冷却至60℃加入溴乙锭2μl（10mg/ml的终浓度0.5μg/ml）

5.       放入梳子，浇板，待凝固

6.       加8μl PCR反应产物+2μl溴酚兰

7.       电泳50-80V（每㎝ 5V）