RT-PCR实验步骤

实验材料：水稻叶片的 RNA 。

实验原理：目前 PCR 技术只能扩增 DNA 模板，对 RNA 模板不能直接扩增。mRNA反转录生成的 cDNA 可作为 PCR 的模板进行扩增，这种在 mRNA 反转录后进行的 PCR 扩增称为 RT-PCR 。 RT-PCR 比 Northern 杂交更灵敏，对 RNA 的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。本实验以水稻叶片 RNA 为材料，检测β -actin 基因的表达。实验中设定2 个阴性对照：一个不加模板 RNA ，另一个不加反转录酶，主要是消除 DNA 及PCR 试剂方面引起的假阳性；同时以叶片 DNA 为阳性对照，检验 PCR 试剂和扩增过程是否有问题。

实验步骤：

RNA 抽提

1. 用TRIzol 试剂提取植物总RNA。

2. 将总RNA 稀释到终浓度1μg/μl 。

3. 在0.5 ml 的无菌eppendorf 管中分别加入:

Total RNA 0.5- １ μ g

RNase-free DNase I １ μ l ( １ u / μ l)

10 × DNase I buffer 1 μ l

DEPC 处理的ddH2O 5 μ l

4. 37 ℃ 保温15 min, 然后70 ℃ 保温10 min. 。

反转录反应

1. 加1μl 500 μ g / ml oligo (dT)15 primer, 涡旋混合，简单离心。

2.在65 ℃加热混合物10 分钟, 然后室温10 分钟，再分别加入下列试剂：5 × 第一链缓冲液4μl、0.1 M DTT 2μl、

10 m M dNTP 1μl

3.涡旋混合后，简单离心，37℃水浴2 min.。

4. 加2μl 200 U / ml 的M-MLV 反转录酶。轻缓混合，37℃保温1h。其总体积应为20μl。

5. 70 ℃加热15 min 终止反应，然后加20μl 的ddH2O ，cDNA 第一链可作为模板用于PCR 扩增。

6. 若要去除与cDNA 互补的RNA，可加1μl (2 units)的RNase H，然后37 ℃保温20 min。

PCR 扩增

1. 在冰上混合加入下列试剂：

cDNA 第一链 1μl

TaKaRa Ex Taq (5u/1μl) 0.5μl

10 × Ex Taq buffer 5μl

dNTP mixture (2mM) 4μl

Primer F (10 mM) 2μl

Primer R (10 mM) 2μl

ddH2O 35.5μl

2. PCR 反应程序

Step 1 94℃ 3min 1

Step 2 94℃ 1min， 60℃ 1min， 72℃ 1min， 30-40 Cycles

Step 3 72℃ 5 min 1

Step 4 4℃ forever

3. 以β-actin 作为每个RT-PCR 的内在标准，以水代替反转录酶来检测RT-PCR中的DNA 污染。

所使用试剂：

5 × 第一链缓冲液 (GIBCO Part No.Y00146)

100 mM DTT (GIBCO Part No.Y11147)

200 U/μl M-MLV Reverse transcriptase (GIBCO Part No.28025-021)

500μg/ml oligo (dT) 15 primer (Promega Cat. No. C110A 9362612)

10 mM dNTP 混合物

RNase-free DNase I (TaKaRa Code No. 2215 CA)

5U/μl Ex Taq polymerase 和10 × buffer (TaKaRa Code No. RR001D CA)

10μM specific Primer F and R

Sterile ddH2O