RT-PCR实验步骤

 

一、组织抽提：

 

1.       取组织块 50-100 �用液氮在研钵中研磨成粉末

 

2.       移入玻璃匀浆器加入 1ml Trizol 抽打匀浆

 

3.       移入 1.5ml 新离心管用 5 ml 针头抽打

 

4.       冰上孵育 5 分钟

 

5.       离心 12,000g  4 ℃   5 分钟 取上清液移入 1.5ml 新离心管

6.       加 0.2 ml 氯仿，震荡，冰上孵育 5 分钟

 

7.       离心 <12,000g  4 ℃   10 分钟 取上层液相移入 1.5ml 新离心管

 

8.       加 0.5 ml 异丙醇，震荡，冰上孵育 5 分钟

 

9.       离心 <12,000g  4 ℃   5 分钟 弃去上清液

 

10.   加入 1 ml 75% 乙醇，震荡

 

11.   离心 <7,500g  4 ℃   5 分钟 弃去上清液

 

12.   室温下使之变透明

 

13.   加入 DEPC 处理水 10 μ l --35 μ l 溶解 RNA （ 可保存在液氮或低温冰箱）

 

14.   走 RNA 变性电泳观察 18s ， 28s 条带，分光光度计检测 260/280 吸光度比值，计算 RNA 浓度

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

二、 RT 反应体系（第一步）：约 20 分钟

 

RNA    抽提物	5 μ l
Radome 引物	2 μ l
RNA sin	0.5 μ l

1.       65 ℃ 15 分钟

 

2.       立即放入冰浴

 

RT 反应体系（第二步）：约 2 小时

 

RNA sin	0.5 μ l
10mM   dNTP	1 μ l
5 × RT  缓冲液	4 μ l
25mM  MgCl2	4 μ l
AMV  逆转录酶	3 μ l

1.       37 ℃ 1.5 小时

 

2.       94 ℃ 5-10 分钟

 

3.       反应物保存于 -20 ℃或进行 PCR

 

三 1 、 PCR 反应体系：约 4.5 小时

 

25mM  MgCl2	2 μ l
10 × PCR 缓冲液	5 μ l
10mM   dNTP	1 μ l
上下游引物 10pmol/ μ l	2.5 μ l × 2
CDNA 模板	2.5 μ l
ddH2 O	34 μ l
Taq 酶	0.5 μ l
轻质石蜡油	50 μ l
	100 μ l

1.       94 ℃ 2 分钟， 55 ℃ 1 分钟， 72 ℃ 2 分钟 为第一个步 1 个循环

 

2.       94 ℃ 45 秒， 55 ℃ 40 秒， 72 ℃ 1 分钟 为第二步 30 个循环

 

3.       72 ℃ 10 分钟

 

4.       取出后 4 ℃ 5 分钟后 -20 ℃保存或走电泳

 

三 2 、 PCR 反应体系：约 5 小时

 

25mM  MgCl2	3 μ l
10 × PCR 缓冲液	5 μ l
10mM   dNTP	1 μ l
上下游引物 10pmol/ μ l	2.5 μ l × 2
CDNA 模板	5 μ l
ddH2 O	30 μ l
Taq 酶	1 μ l
轻质石蜡油	50 μ l
	100 μ l

1.       94 ℃ 2 分钟， 55 ℃ 1 分钟， 72 ℃ 2 分钟 为第一个步 1 个循环

 

2.       94 ℃ 45 秒， 50 ℃ 40 秒， 72 ℃ 1 分钟 为第二步 40 个循环

 

3.       72 ℃ 10 分钟

 

4.       取出后 4 ℃ 5 分钟后 -20 ℃保存或走电泳

 

四、电泳：约 1.25 小时

 

1.       配 0.5 × TBE 电泳缓冲液 300 ml

 

2.       胶浓度 1.7% （ 40ml 0.5 × TBE 加 0.68g 胶）

 

3.       微波炉中火 2 分钟溶解胶

 

4.       冷却至 60 ℃加入溴乙锭 2 μ l （ 10mg/ml 的终浓度 0.5 μ g/ml ）

 

5.       放入梳子，浇板，待凝固

 

6.       加 8 μ l PCR 反应产物 +2 μ l 溴酚 兰

 

7.       电泳 50-80V （ 每� 5V ）