RT-PCR反应液调制及反应设置
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一、按下列组成在PCR 反应管中调制反应液
| Reagent | Quantity,for 50µl of reaction mixture |
|---|---|
| 10×One Step RNA PCR Buffer | 5µ l |
| 25 mM MgCl2 | 10µ l |
| 10 mM dNTP mix | 5µ l |
| RNase Inhibitor (40 U/µ l) | 1µ l |
| AMV-OptimizedTaq | 1µ l |
| AMVRTaseXL (5 U/µ l) | 1µ l |
| 上游特异 Primer(20 µ M) | 1µ l |
| 下游特异 Primer(20 µ M) | 1µ l |
| 实验样品 RNA（≤ 1 µ g Total RNA） | 1µ l |
| RNase Free dH2O | 24µ l |
| Total | 50µ l /Sample |
1. 反应总体积根据实际情况进行调控，可以做20~50µl 以节约试剂；
2. 将上表各成分加入到0.2ml 或0.5ml 灭菌的PCR 薄壁管中；
3. 如果不用PCR 仪的加热盖，在反应混合液的上层加30 ~ 50µl 的矿物油防止样品在 PCR的过程中蒸发；
二、按以下条件进行反应
| Step | Temperature,° C | Time,min | Number of cycles | Note |
|---|---|---|---|---|
| 逆转录 | 50 | 30 | 1 | |
| 逆转录酶失活 | 94 | 2 | 1 | |
| 变性 | 94 | 0.5 | 25-35 | |
| 退火 | 37-65 | 0.5 | 退火温度比理论退火温度大概低 5°C再根据反应结果优化 | |
| 延伸 | 72 | 根据扩增产物的大小 | Taq 酶每分钟延伸1000bp | |
| 最终延伸 | 72 | 10 | 1 |
反应结束后，抽取扩增样品5µ l，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNAmarker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。
