【分享】RT-PCR的反应体系

一：25UL 体系的量如下：

无RNA酶水 ？

undefinedbuffer 5.0UL

DNTP Mix 1.0UL

Enzyme Mix 1.0UL

primer A ?(0.6M)

Primer B ?(0.6M)

RNA模板 ？（不大于1UL）

Q (RNA酶抑制剂） 可加可不加

二：虽说有几个试剂未知其量，但都是需要算的，给据要求，引物及RNA模板都可计算,具体如下：

1. 引物量的计算：

跟据引物说明书稀释引物，例如：

primer A 1OD 48UL 意思实说：1OD （一般公司给合成的为每管1OD,量为100M）引物加48UL 0.1%DEPC处理12小时以上并高压过的水，混匀，即为母液；然后取10UL于另一EP管中，加30UL0.1%DEPC处理12小时以上并高压过的水，用移液器吹打混匀，即为工作液。注明稀释日期及性质，-20度冰箱备用。

所需引物量为=(0.6undefined40Uundefined48UL)/(100undefined10UL)

同理 Primer B的计算相同 。

2.RNA模板的计算：

一般25UL反应体系中，需500ng或1ug的量，如按照1ug计算：

（1）总RNA浓度一定要知道:可通过测吸光度来计算，1OD=40ug，公式如下：

总RNA浓度=OD值40uundefined稀释倍数/1000 (ug/uL)

（2）所需RNA模板量为=1/总RNA浓度 (uL)

这样水的量就自然定了。

三：具体步骤

（1）先将所用的试剂放于冰盒上

（2）把除引物外的其它试剂都加好，用移液器混匀

（3）再加模板RNA并混匀

（4）将EP管放于已预热的PCR仪中，按照已经设定好的条件开始循环。

四：条件

50° 30min,95° 15min .(94° 45s,Tm-5°,72° 1min~undefined35cycle ,72° 10min ,----4°

待PCR仪中的温度降到4°时，取出RT-PCR产物，电泳，并置于-20°冰箱保存