增进RNAi分析的强大工具

利用RNAi的威力

RNA干扰（RNA interference RNAi）正在迅速成为最受欢迎的阻断特异基因表达的技术。RNAi技术允许科学家关闭他们想要研究的基因，这是一种全新的令人激动的研究方法，通过研究基因表达缺失时细胞的表型，以确定基因的功能。最初，通过在无脊椎动物如：果蝇（Drosophila）和线虫（C. elegans）导入长的双链RNA，揭示了RNAi是一种降低特异基因表达的强有力的方法（综述1，2）。现在可以使用修饰的RNAi阻断技术，在真核细胞中进行分析。BLOCK-iTTM RNAi技术允许你利用RNAi的威力――利用各种各样的技术――进行基因阻断的研究。

内源RNAi机制

RNAi在真核细胞中的发生过程是通过一个被称之为Dicer的酶，将长的dsRNA裂解成21-23核苷酸的短的干扰RNA（siRNA）。siRNA变成细胞内RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex RISC）的一部分，该复合物通过互补靶定将要降解的细胞内的mRNA，最终将细胞中的基因表达阻断。

BLOCK-iT™ RNAi技术提供了以下种在细胞中产生siRNA的方法：

· 体外转录和Dicer酶切双链RNA(dsRNA)

· 合成siRNA

· 携带RNAi框的载体

想要发现更多的有关哪种方法最利于你现在和将来的RNAi应用，请继续阅读。

适合全部RNAi研究目标

帮助你获得全部RNAi实验所需要的抑制水平。你可能处于分析的初始阶段、需要对几个基因进行筛选和研究、想要使用siRNA以确定最有效的靶定序列或者研究原代哺乳动物细胞的长期表达。无论什么样的实验，BLOCK-iT™产品都会有对你的实验有用帮助（表1）。

表1 发现你需要的BLOCK-iT™产品产品应用优势

产 品	应 用	优 势
BLOCK-iT™ Dicer RNAi Transfection Kit	哺乳动物细胞中分析RNAi反应	·快速的结果－立刻产生RNAi数据 ·有效阻断－酶切的siRNA序列库（d-siRNA）可能包含大量高效的双链siRNA ·节省时间－不需要设计和预先确定最佳的靶定序列 ·成本低廉－一个试剂盒可以进行数百次实验
Lipofectamine™ 2000	最广泛被使用的哺乳动物细胞siRNA转染试剂	·已证明的转染－提供成功的基因阻断 ·转染多种类型细胞－在大部分哺乳动物细胞中进行高效的siRNA和d-siRNA的转染
BLOCK-iT™ RNAi TOPO® Transcription Kit	产生长的dsRNA，直接用于无脊椎动物RNAi分析	·简单而有效－高产量制备双链dsRNA转录本·方便－可以从任何PCR产物开始
BLOCK-iT™ Oligonucleotides for RNAi	ssRNA或者siRNA寡核苷酸	·可测量－确定达到最佳特异性和阻断水平的最好的靶序列·快速的结果－立刻获得数据·容易－简单的设计、订购和转染
Stealth™ RNAi and validated StealthTMRNAi collection	修饰合成的Stealth™ RNAi分子和功能验证的Stealth™ RNAi库进行RNAi分析	·更清晰的结果―避免非特异应激反应 ·更高的特异性―仅仅靶定目的基因 ·更大的稳定性―在血清中不会快速降解
BLOCK-iT™ U6 RNAi Entry Vector	在大部分哺乳动物细胞中瞬时siRNA表达	·简单、快速地克隆shRNA序列－方便地筛选多个基因或者序列·成本低廉－使用两个ssDNA oligo·很容易转移U6框到其它载体－att位点提供有效的重组
BLOCK-iT™ Lentiviral RNAi Expression System	在分裂和不分裂哺乳动物细胞或者动物模型中均可获得稳定的shRNA表达	·长期、有效的RNAi分析－有效的慢病毒整合 ·简单的U6框重组－att位点使得从U6入门载体的转移快速而简单 ·有效的慢病毒转导－为动物模型、难于转染、原代和不分裂细胞类型提供可重复的结果
inducible H1 RNAi systems	在分裂和不分裂的细胞中进行可诱导表达RNAi分析	·研究抑制会导致细胞死亡的基因 ·可调控－控制RNAi反应的启动以满足使用的需要 ·研究不存在shRNA连续表达时可能发生的补偿机制激活时的表型

使用Dicer进行快速而简单的筛选

BLOCK-iT™ Complete Dicer RNAi Kit和 BLOCK-iT™ Dicer RNAi Transfection Kit提供了一个快速而简单，基于细胞分析的RNAi分析方法，可以鉴别多达5个基因。你不需要知道进行阻断的最佳siRNA靶序列。只需要从作为BLOCK-iT™ Dicer反应模板的dsRNA开始，按照优化步骤，加入高活性的Dicer酶，以获得来自于长dsRNA的d-siRNA库。然后，通过柱（spin column）纯化产生高纯度的d-siRNA库，接着，使用Lipofectamine™ 2000 试剂有效地转染细胞。最终，通过使用BLOCK-iT™ Dicer Kits高水平特异地阻断基因（图2）。

图2 使用BLOCK-iT™ Complete Dicer RNAi Kit得到＞80％的靶定基因阻断

经Dicer酶切的，来源于β-半乳糖苷酶或者荧光素酶的dsRNA产生siRNA（d-siRNA）库，用来确定d-siRNA特异阻断基因活性的效果。GripTite™ 293 MSR 细胞共转染pcDNA™1.2/V5-GW/lacZ阳性对照质粒和pcDNA™5/FRT/luc，分别独自表达β-gal或者荧光素酶报告子，或者50ng luc 或者lacZ d-siRNA。对于每一种报告子，各自纯化的d-siRNA有效地减少了报告子表达的活性，而源自其它转录本的d-siRNA则没有作用。

BLOCK-iT™ Dicer酶切技术的优点

由于每一个Dicer酶切转录本库存在大量高效的siRNA，你可以对自己的结果充满信心。BLOCK-iT™ 制备siRNA Dicer酶切方法与当前使用RNA干扰快速筛选基因的其它方法相比较，有以下几项优势。BLOCK-iT™ Dicer RNAi Kit提供：

· 通过直接进入筛选阶段，避免大量的siRNA设计步骤而节省时间

· 通过消除鉴定可利用mRNA靶定位点或者其特异性的不必要的分析而立刻获得数据

· 通过使用d-siRNA混合物而确保有效的阻断

利用这些优点，即使出现等位基因变异，你也会在各种类型细胞中获得有价值的结果。为了在你的系统中获得最初的siRNA数据，使用BLOCK-iT™ Dicer RNAi Kit是最好的选择。

更有效的产生siRNA

高质量的BLOCK-iT™ Dicer 酶有效地产生21-23个核苷酸的双链siRNA，这些被切割的产物对特异基因表达的阻断非常有效。其它的RNase III通常会产生更小的产物（图3），这些小的RNA，即使是在高浓度下，可能对RNAi反应不是很有效（图4）。利用BLOCK-iT™ Dicer 方法有效地阻断基因的表达。使用BLOCK-iT™ Dicer RNAi Kit，你可以立刻得到结果，无需借助其它RNase III 酶制备的小片段，而且这些小片段可能不一定能提供你需要的阻断。

图3 Dicer酶切dsRNA 产生RNase III 酶裂解所不能产生的21-23 nt的d-siRNA

   按照生产商的说明书，使用BLOCK-iT™ Dicer Complete RNAi Kit和购买到的利用RNase III 酶的试剂盒产生d-siRNA。BLOCK-iT™ Dicer Complete RNAi Kit产生的大小为21-23nt的核苷酸（泳道2），RNase III 酶的产物12-15个核苷酸（泳道3）。通过与100bp的ladder比较显示（泳道1）。（4％E-Gel）

图4 使用BLOCK-iT™ Dicer 酶比使用一种细菌RNase III 酶产生的siRNA 提供更好的结果

GripTite™ 293 MSR 细胞转染lacZ和荧光素酶（luciferase）对照报告子，单独转染或同10ng或200ng的RNase III产生的siRNA或者Dicer产生的d-siRNA共转染（如图3所示）。在使用Lipofectamine™ 2000 转染48小时后，检测荧光素酶和β-gal活性。图示β-gal对荧光素酶比率，没有观测到荧光素酶表达的非特异性抑制。

获得有效RNAi结果所需要的的一切

BLOCK-iT™ Complete Dicer RNAi Kit提供获得和转染目的基因特异的siRNA库所需要的一切，包括：

· 高质量的Dicer酶，提供高产量的21-23个核苷酸的d-siRNA，有效的产生预期的RNAi结果

· 专门开发的RNAi纯化模块，从酶切反应物中纯化d-siRNA

· 提供已证明对哺乳动物细胞高效转染的、易于使用的Lipofectamine™ 2000转染试剂――对于有效的基因阻断至关重要

· BLOCK-iT™ RNAi TOPO® Transcription Kit提供高产量的长dsRNA的快速合成

使用BLOCK-iT™ Complete Dicer RNAi Kit，你可以筛选多达5个基因，同时得到可靠的结果。你将会快速进入到RNAi研究的下一阶段。

快速、高产量的RNAi TOPO®转染试剂盒

如果使用线虫或者昆虫细胞进行RNAi分析，BLOCK-iT™ RNAi TOPO® 转染试剂盒（BLOCK-iT™ RNAi TOPO® Transcription Kit）是你理想的转染试剂盒。你可以获得高产量的纯的长dsRNA，直接用来分析基因阻断的效应。一些没有干扰反应的哺乳动物细胞干细胞，在转染的长dsRNA后产生了效应。使用这个试剂盒你将会：

· 很容易地通过在任何PCR产物上连接BLOCK-iT™ T7-TOPO? 接头（BLOCK-iT™ T7-TOPO® linkers）产生正义和反义的转录本。

· 获得合成、纯化和退火RNA转录本所需要的一切，直接用来在无脊椎动物和一些哺乳动物胚胎细胞中进行RNAi分析。

· 与BLOCK-iT™ Dicer RNAi Transfection Kit合并使用时，可以重复获得高纯度的d-siRNA库。

图5 BLOCK-iT® 合成的转录本在昆虫S2细胞产生清晰的结果

为了显示内源基因功能的抑制，使用胞质分裂启动需要Drosophila guanyl-nucleotide exchange factor (pbl)进行RNAi分析转染pbl长dsRNA后，观察到独特的表型。使用BLOCK-iT™ RNAi TOPO® 转染试剂盒产生长dsRNA，接着使用Cellfectin®试剂转染pbl长dsRNA或者非特异性荧光素酶dsRNA。转染3天后，在存在dsRNA的S2细胞中，直径异常大的细胞在正常细胞的背景中非常明显（右2列）。这种大小的细胞在无转染对照细胞或者或者在转染荧光素酶的细胞（左列）中几乎很少被看到，表明pbldsRNA诱导了表型。表明pbldsRNA诱导了表型。

高质量的合成siRNA或者ssRNA

想要成功鉴定基因阻断的最佳序列，重要的是开始时就使用高质量无错误的siRNA寡核苷酸。我们提供高质量的siRNA序列合成服务，包括单链和双链的BLOCK-iT™ RNA寡核苷酸（BLOCK-iT™ RNA Oligonucleotides），可选择50或者200nmole合成量（表2）。定制BLOCK-iT™ siRNA寡核苷酸服务（BLOCK-iT™ RNA Oligonucleotide Service）使用独特的平行阵列合成仪（Parallel Array Synthesizer PAS)，以及新颖的去保护系统和广泛的偶联效率监测，因而，你可以对siRNA生产的每一步的质量放心。此外你将会获得：

表2 纯化和产量  规 模 长 度 脱 盐 HPLC

规 模	长 度	脱 盐	HPLC
50 nmole	＞20 碱基	5 OD	1 OD
50 nmole	< 20 碱基	2 OD	0.5 OD
200 nmole	＞20 碱基	20 OD	3 OD
200 nmole	< 20 碱基	8 OD	3 OD

通过接受BLOCK-iT™ siRNA寡核苷酸服务，你可以确信你看到的实验结果是由于你定制的序列――而不是oligo序列错误或者其它的污染。

"想要了解详情请登录：http://www.invitrogen.com.cn/other/link/Custom.htm

PAS合成oligos的良好的结果

定制BLOCK-iT™ siRNA寡核苷酸是在高度自动化、计算机控制的PAS上进行精确地合成的。Invitrogen 独特的PAS系统可以在行业标准格式的96孔合成板上同时平行地合成96个定制oligos。这个过程的先进的"流程"减少了污染的风险和操作的错误，确保你得到高质量的和精确的合成产物。独特的空气过滤干燥系统确保你的siRNA在运输过程中保持稳定。通过独特的专利软件和用来制备siRNA oligos的PAS系统，你将会：

· 减少核苷酸错误的风险

· 有效的基因阻断（图6）

· 快速而简单的oligo还原（reconstitution）

使用BLOCK-iT™ siRNA寡核苷酸，发挥它的最大效力，你将会获得你需要的结果。

图6 BLOCK-iT™ siRNA寡核苷酸特异抑制基因的表达

使用Lipofectamine™ 2000,在GripTite™ 293 MSR细胞中转染两个报告子构建，一个表达荧光素酶，另一个表达β-半乳糖苷酶，以及荧光素酶特异siRNA序列的BLOCK-iT™ siRNA寡核苷酸（luc siRNA）。检测存在和不存在luc siRNA时荧光素酶和β-gal的活性。尽管luc siRNA对β-gal的活性没有影响，但是荧光素酶的活性却明显被抑制。荧光素酶对β-gal的比率证明了siRNA抑制基因的活性的特异性和有效性。

最有效地转染siRNA

通过Lipofectamine™ 2000试剂成功地转染siRNA，在种类广泛的细胞中导致基因表达的明显阻断（图7）。使用Lipofectamine™ 2000转染你的siRNA，你将获得：

· 在哺乳动物细胞中进行有效基因阻断的高效转染

· 操作简单的步骤

· 广泛细胞类型上的卓越性能

让Lipofectamine™ 2000成为你成功siRNA转染和基因阻断的钥匙。使用Lipofectamine™ 2000，你――而不是你的转染试剂――选择了进行你的基因沉默研究最好的细胞系。

图7 使用Lipofectamine™ 2000转染siRNA导致明显的阻断

稳定表达荧光素酶的CHO, 293,或者BHK细胞转染前24小时铺板。20 pmol (293, BHK) 或者10 pmol (CHO)的荧光素酶siRNA或者非特异性的siRNA稀释在GIBCO™ Opti-MEM®中，与稀释的Lipofectamine™ 2000混合，直接加入到细胞中。转染后24小时分析荧光素酶活性。转染后24小时分析荧光素酶活性。

LUX™引物是RNAi研究的理想工具

LUX™ (Light Upon Extension) 荧光引物提供了一种灵敏、特异和低费用的，使用实时PCR确定RNAi阻断的方法。每一个LUX™引物对包含一条使用单一荧光标记的引物和一条相对应的引物，二者均根据目的基因的特异序列而设计。这对引物就是你进行PCR和实时检测PCR产物所需要的全部，不再需要额外的探针或者淬灭物。你可以很划算地得到出色的实时结果。LUX™引物是你确定siRNAi实验效果的理想方法。

流水线克隆多个目的序列的载体

BLOCK-iT™ U6 RNAi 入门载体（ BLOCK-iT™ U6 RNAi Entry Vector）和 BLOCK-iT™ 病毒 RNAi 载体（BLOCK-iT™ Viral RNAi vectors）提供 了一种简单、流水线克隆多个短的发夹RNA（shRNA）目的序列的方法，可以检测使用腺病毒或者慢病毒的瞬时转染和随后的表达。一种新颖简单的克隆过程被用来产生插入短的DNA寡核苷酸的载体，寡核苷酸紧跟着人类U6 pol III启动子，并且位于pol III终止子上游。RNAi框包含与目的靶标基因互补的正义和反义区域以及"环"核苷酸，在细胞中被转录成shRNA分子（图8），shRNA被加工成siRNA，产生RNAi效应。一旦完成克隆，BLOCK-iT™ U6 RNAi 入门构建很容易被用来进行瞬时转染实验的最初的筛选。如果想要对不分裂细胞和难于转染的细胞系、原代细胞或者动物模型进行有力的转染，你可以很容易地将RNAi框转移到BLOCK-iT? RNAi慢病毒和腺病毒载体。

图8 创建带有RNAi框的哺乳动物表达载体

dsDNA寡核苷酸退火，在室温下与线性的pENTR™/U6载体共同孵育5分钟，混合物转化One Shot® TOP10 Competent E. coli.感受态细胞。获得的质粒可以直接用来进行瞬时转染，来自U6启动子的shRNA形成一个发夹结构，然后被加工成siRNA分子。然后被加工成siRNA分子。

在各种哺乳动物细胞中有效的转染和长期的shRNA表达

你将可以使用293FT细胞系和相关的ViraPower™ 试剂制备的高滴度的慢病毒储备液，进行有效的和可控制的导入。一旦制备好了慢病毒储备液，就可以转染细胞以观测RNAi反应（图9）。pLenti6/BLOCK-iT™-DEST 慢病毒 RNAi 载体（ pLenti6/BLOCK-iT™-DEST Lentiviral RNAi vector）提供能够长期观察稳定RNAi效应的能力。这个载体包含包装U6RNAi框到病毒所需的全部的元件，因而你能够转染shRNA到正在分裂、难于转染和不分裂的细胞中（图10）。此外，pLenti6/ BLOCK-iT™-DEST包含：

· attR位点提供U6 RNAi框从U6 RNAi入门载体上有效的重组

· 病毒转导组分和好几个安全特点提供了安全有效的转导

· 杀稻瘟菌素（blasticidin）选择标记提供表达shRNA稳定细胞株快速而高效的选择

这些特点为你在难于转染、原代和其它不分裂哺乳动物细胞以及在动物模型中进行瞬时或者长期稳定RNAi实验，提供了很大的灵活性。

图9 通过慢病毒转导阻断内源基因的表达

HeLa细胞转导MOI递增的pLenti6/BLOCK-iT®病毒，病毒编码靶定荧光素酶（对照）或者Lamin A/C 的shRNA。转导5天后，细胞裂解物进行western blot，使用抗Lamin或者抗β-actin抗体检测。靶定Lamin的shRNA抑制了lamin的表达，但是却不影响β-actin的表达。对照荧光素酶的shRNA对lamin的表达没有影响。

图10 使用pLenti6/ BLOCK-iT™-DEST RNAi载体

使用LR Clonase™ II酶混合物进行一小时的重组