FFPE样本空间转录组实验流程，你想要的细节都在这里了

10x Visium空间转录组测序针对FFPE样本的实验已经开展有一段时间了，今天小编就来总结一下整个实验的详细流程。

 

首先来一张实验流程导图：

 

10xVisium FFPE的实验流程

 

FFPE样本Visium空间转录组技术流程（图片引自10x官方）

一、取材

FFPE样本取材要求组织不要大于6.5mundefined6.5mm，因为10x visum的每张切片的捕获区域只能容纳6.undefined6.5的组织大小，≤6.5 x 6.5 mm的组织块可与Visium Spatial玻片兼容；对于≤6.5 x 6.5 mm的组织，从组织周围去除多余的石蜡，使其不大于捕获区域就好，并且还能保留组织样本周围的石蜡边缘，以增强组织在玻片上的附着力；对于>6.5 x 6.5 mm的组织，用刀片切掉多余的部分，形成适合捕获区域的样本，但是由于可能会出现组织裸露，边缘没有石蜡包裹，不利于组织粘附，并且在切掉多余的组织的时候可能还会导致组织损伤和解体。所以最好是在组织包埋的时候就要修剪好组织大小，以便适合捕获区域。

 

样本取材包埋成石蜡块以后，尽量放在低温保存，有研究表明，低温更有利于RNA的完整性的保持。

doi: 10.1371/journal.pone.0001261.

二、石蜡切片

收到样本以后公司会进行石蜡切片，为了能更好的把切片贴到Visium Spatial玻片的捕获区域，需要先切一些切片来摸索样本在水浴中的展片时间，用Milli-Q水注满水浴，确保温度设定在42°C，并且没有气泡和颗粒物；将切片机设置为5μm（区别于OCT样本切片的10-15μm），开始切片。对于有暴露组织的组织块，丢弃前几个切片，开始收集后续的切片，让切片漂浮在水浴表面，直到它的大部分是平的，没有皱纹；漂浮的时间取决于样品的类型。如果切片有太多的褶皱或折叠，让它漂浮更长时间；通过这个摸索大概确定展片时间。

三、质控I——RNA完整性检测


 

收到样本以后，公司会先切10-15张片子进行RNA质量的检测，切片厚度可以比正式贴片的片子稍微厚一些，一般会切10μm左右，FFPE样本进行空间转录组实验，对RNA的质量要求：DV200>50%，即>200bp的RNA 片段占比大于50%为最低要求，视为合格的样本，可以继续进行下面的实验。 

 

四、质控II——切片粘附性实验

切片脱蜡染色再复水，显微成像观察脱片情况，保证正式实验样本切片能牢固的粘附在玻片上，防止后续实验过程中加各种试剂或洗涤浸水导致切片脱落。

五、质控III——切片形态学检测

 

FFPE样本通过HE染色以后，观察组织的形态学特征是否完整，是否符合实验需求等；若以上的三个质检都通过，那么则可以开始正式贴片。

六、正式贴片

a. 在使用Visium Spatial玻片之前，先在普通玻璃玻片上练习切片放置，为了提高捕获区的可见度，用永久性记号笔在玻片背面描画靶标框架，以模仿Visium Spatial基因表达玻片。

b. 将切片转移到水浴中，用之前摸索的展片时间展片，直到片子全部展开，无褶皱；

c. 将载玻片插入水中，在保持载玻片笔直的同时，将靶标框架与水面对齐。

d. 使用画笔或探针，将切片操纵到载玻片上捕获区的顶部。断面的边缘必须对准与水面对齐的基准线框架。

e. 将载玻片拉起并离开水面，确保下面没有气泡残留，然后放在一边。首先将切片放在最上面的捕获区。

f. 对其余的捕获区重复上述步骤，确保之前的切片不会再次被浸入水中。



























贴片时要注意：切片要完全干燥，组织切片不要盖住玻片每个捕获区域的的框架；贴片不要发生折叠和褶皱；若一个捕获区域想要同时贴多张切片，切片之间不要发生重叠；防止玻片和切片间存在气泡等。

七、探针杂交连接

在空间转录组的实验过程中，FFPE样本有不同于OCT样本的地方，OCT样本质检合格以后，将组织切片贴到玻片的捕获区域，用已经摸索好的透化条件进行透化，释放出细胞中的RNA，释放出的RNA直接与玻片上的RNA捕获探针结合后，进行扩增建库测序，获取组织的基因表达信息。

 

针对FFPE样本的特殊性，10x Visium目前针对小鼠（约1.8万个基因）和人（约2万个基因）的基因数据库设计了探针，每一个基因（人和小鼠），都预先设计了一对probe以靶定RNA的特定序列，LHS（左端探针）带有read2序列，用以后续PCR扩增，RHS（右端探针）带有polyA序列，用以后续被玻片上的探针捕获结合，通过probe与组织内RNA杂交，将RNA信息转移到probe上，再将探针两端连接形成完整的DNA链。之后降解杂合RNA链，然后透化释放连接的probe，完成信息捕获过程（FFPE样本不需要针对不同类型的样本摸索透化条件，所有的样本类型都用同样的透化条件）。

 

捕获的probe在玻片上进行延伸反应，生成cDNA，回收单链cDNA并构建测序文库进行上机测序，从而获取基因表达信息。载玻片上的每个捕获区域都有一个oligo阵列，每条oligo上包含与probe结合的捕获探针，该oligo同时具备描述空间信息的标记性序列。

 

基于探针设计捕获方式，FFPE样本文库构建大小在240bp左右，不同于冰冻组织450-470bp；测序深度在25k reads pair/per spot左右即可满足分析需要，不同于冰冻组织50k reads pair/per spot的要求。


 

八、总结

FFPE样本空间转录组实验流程相对OCT样本来讲，操作更加繁琐复杂，消耗的时间更长，但是它突破了过去从FFPE样本组织中获取空间基因表达信息的障碍，使得长期保存的珍贵样本的空间基因表达信息也能够检测到，能更好的利用现有的临床样本库资源进行回溯性研究等，实现病理图像化和基因数字化的完美结合。

 

吉凯承接过的部分空转样本类型