免疫细胞化学呈阴性

paipaihe：24孔中，对已成功转染GFP的细胞进行免疫细胞化学检测

1抗使用GFP 单抗（鼠源）

2抗使用羊抗鼠的HRP标记2抗

经染色后未见任何阳性显色细胞，

请问各位可能的原因都有那些呢？

 

我的具体操作是

1.4%多聚甲醛固定30分

2.triton-100 透化 15分

3.3%H₂O₂/甲醛 10分

4.5%BSA 60分

5.1抗 60分

6.2抗 60分

7.染色

丁香园网友byd123认为：

有几个问题：

1）如何知道是已成功转染GFP的细胞？

2）3%H₂O₂/甲醛10分？

应该是3%H₂O₂/甲醇30分

3）5%BSA 60分

改为1%BSA 30分

4）1抗60分

改为1抗过夜

5）2抗60分

是在37度吗？

6）染色

你用什么染色的？多长时间？

7）重要的是，你是否做过抗体的棋盘滴定？

一抗按比例稀释，1：200，1：400，1：800......

二抗可选用推荐最高浓度

呵呵，这些问题搞清楚，才能知道原因

丁香园网友paipaihe认为：

GFP已在荧光显微镜下得到验证

我用的DAB染色方法

还有个问题，我的一抗浓度很高，过高的一抗浓度会影响结果吗?

丁香园网友byd123认为：

一抗浓度很高，会加强非特异性染色的，所以抗体要做棋盘滴定的，找出一个最佳浓度，呵呵，这样，片子才漂亮。