慢病毒高分论文应用案例

STTT|雷公藤红素抗癌靶标新发现

雷公藤红素，又名南蛇藤素，是从雷神藤中分离出的最具前途的天然药用产物之一，对多种肿瘤类型均有较显著的抑制作用。然而，雷公藤红素具有较严重的副作用，所以它的临床应用受到严格限制，同时，由于其发挥抗肿瘤活性的分子靶标和作用机制不够清晰，缺乏雷公藤红素与靶标的复合物晶体结构，使得基于其化学结构改造开发高效低毒的雷公藤红素衍生物缺乏明确的指导方向。

2023 年 2 月 3 日，中科院上海药物所张豪与上海交通大学徐颖、张翱为共同通讯作者在《Signal Transduction and Targeted Therapy》（IF=38.104）发表了题为：「Celastrol suppresses colorectal cancer via covalent targeting peroxiredoxin 1」 的研究论文，在这里，作者开发了一种新的靶标富集排序工具—OTTER，并利用这个新工具结合生物化学、生物物理等技术手段，发现过氧化物还原酶 1（peroxiredoxin 1, PRDX1）是结直肠癌中雷公藤红素的靶蛋白，并首次解析了雷公藤红素与 PRDX1 蛋白的复合物晶体结构，又基于晶体结构分析，设计并合成了特异性及体内安全性显著提高的雷公藤红素衍生物 19-048，证明了雷公藤红素的体内毒性，可以通过靶标发现及基于结构的化学优化而降低，同时表明，抑制 PRDX1 有望用于治疗结直肠癌。值得注意的是，本研究使用了汉恒生物提供的针对 PRDX1 的 CRISPR-Cas9 慢病毒。

下面，我们一起来看具体的研究结果：

首先，作者通过 RNA 测序得到用雷公藤红素处理后的差异表达基因，然后用 OTTER 富集雷公藤红素的氧化还原相关靶蛋白，发现雷公藤红素对过氧化物还原酶（peroxiredoxin, PRDX）蛋白家族的若干成员有较明显的酶活抑制，其中，雷公藤红素对 PRDX1 蛋白的酶活抑制最强，进一步的质谱数据以及点击化学实验提示，雷公藤红素与 PRDX1 的第 173 位半胱氨酸共价结合。

图 1. 雷公藤红素抑制 PRDX1 酶活

先前的研究预测，雷公藤红素以立体特异性方式与靶蛋白共价结合，这可能会影响雷公藤红素的靶蛋白选择性，作者将 PRDX1 与雷公藤红素复合物晶体结构解析为 1.76 埃，揭示了其独特的结合模式。每个 PRDX1 蛋白二聚体，能够共价结合两分子的雷公藤红素，并且这两分子雷公藤红素能够与临近的 PRDX1 蛋白二聚体形成非共价的氢键以及疏水相互作用。

图 2. 雷公藤红素与 PRDX1 蛋白的复合物晶体结构

为了获得更高效和更具有特异性的新型 PRDX1，作者合成了雷公藤红素的衍生化合物，其中 19-266 与 19-048 通过胍末端取代法合成，而 19-048 对 PRDX1 表现出高效的特异性和酶活抑制效果。

由于 PRDX1 通过清除 ROS 密切参与人类结直肠癌的发展，所以作者又证实了雷公藤红素和 19-048 治疗后能抑制结直肠癌细胞的增殖以及降低细胞活力。为了确定雷公藤红素和 19-048 是否通过靶向 PRDX1 影响细胞氧化还原状态，作者在 SW620 和 HCT116 细胞中用 DCFH-DA 荧光探针染色检测 ROS 水平，在不同浓度的雷公藤红素和 19-048 处理后，与对照相比，细胞中的 ROS 含量急剧升高，随后检测了雷公藤红素和 19-048 对 NCM460 细胞中 ROS 水平的影响，结果表明，雷公藤红素和 19-048 对正常细胞 ROS 诱导的影响小于癌细胞，后面作者又证明了雷公藤红素和 19-048 诱导的 ROS 升高会导致结直肠癌细胞的周期停滞和凋亡。

图 3. 雷公藤红素衍生物 19-048 具有更高的效力和特异性

为了验证 PRDX1 是雷公藤红素和 19-048 在结直肠癌细胞中诱导细胞周期停滞和凋亡的主要靶蛋白，作者在 SW620 细胞中通过 CRISPR-Cas9 系统构建了 PRDX1 敲低细胞系（SW620-gPRDX1），用阴性 sgRNA（SW620-gNS）作为对照，与对照相比，SW620-gPRDX1 细胞中 ROS 积累增加，用雷公藤红素或 19-048 处理进一步增强了 ROS 升高的程度，相反，PRDX1 过表达显著逆转了雷公藤红素和 19-048 诱导的 ROS 升高。而且观察到 SW620-gPRDX1 的 G1/M 细胞周期停滞和细胞凋亡增强，过表达 PRDX1 显著减弱了雷公藤红素和 19-048 诱导的这些作用。这些结果表明，PRDX1 是雷公藤红素和 19-048 在结直肠癌细胞中的主要靶蛋白，PRDX1 的抑制导致细胞内 ROS 升高以及细胞周期停滞和凋亡增加。

图 4. 雷公藤红素和化生物 19-048 通过靶向 PRDX1 抑制结直肠癌细胞增殖

为了在转录组水平上证明雷公藤红素和化合物 19-048 在结直肠癌细胞中的作用，作者收集并分析了 SW620 和 HCT116 细胞的 RNA 测序数据，然后用雷公藤红素和 19-048 处理细胞后获得差异表达基因（DEG），使用生物信息学方法分析显示，P53 信号通路是其中排名最高的癌症相关信号通路。根据 RNA 测序数据，作者分别从 SW620 和 HCT116 细胞中总共选出了来自 p53 通路中的 26 个 DEG，并用雷公藤红素和 19-048 处理后测定它们的 RNA 表达水平。QPCR 和 WB 结果表明，用雷公藤红素和 19-048 处理后，这些 DEG 的表达水平升高，而 ROS 清除剂-NAC 阻断了这些基因的转录上调。总之，这些结果表明，在雷公藤红素和化合物 19-048 的存在下，激活的 p53 下游基因参与了 PRDX1 抑制引起的细胞周期停滞和凋亡。

图 5. 雷公藤红素和 19-048 影响的相关信号通路和基因

为了确定 PRDX1 是否是雷公藤红素和 19-048 在体内的主要靶蛋白，作者使用已建立的 SW620-gPRDX1 和 SW620-gNS 细胞进行裸鼠成瘤，来评估 PRDX1 敲低对这些化合物抗肿瘤功效的影响。当肿瘤生长到 50mm 时，小鼠用雷公藤红素和 19-048 进行治疗，结果表明雷公藤红素和 19-048 抑制了 SW620-gNS 肿瘤的进展。同时，作者对小鼠进行了毒性试验，结果表明，与雷公藤红素相比，19-048 在体内的安全性显著提高。免疫组织化学染色显示，在 SW620-gNS 移植小鼠中，随着雷公藤红素和 19-048 处理，GADD45G 和γ-H2AX 蛋白水平升高，而 PRDX1 的敲低减弱了雷公藤红素和 19-048 导致的 GADD45G 和γ-H2AX 蛋白的上调，与肿瘤体积和重量的趋势一致。这些结果表明，雷公藤红素和化合物 19-048 通过靶向 PRDX1 抑制体内结直肠癌肿瘤生长。

图 6. 雷公藤红素和 19-048 通过靶向 PRDX1 抑制结直肠癌的肿瘤生长

综上，作者用他们新开发的靶标富集排序工具，结合生化以及生物信息学手段，发现雷公藤红素的靶标-PRDX1，通过雷公藤红素与 PRDX1 复合物的晶体结构，建立了雷公藤红素如何与靶标蛋白发生共价修饰作用的结构基础，同时，基于晶体结构分析，作者设计合成的雷公藤红素的衍生物 19-048 表明雷公藤红素的副作用可以通过结构修饰来减少。此研究为更多重要天然产物的靶标发现提供了可以借鉴的研究策略以及实用的靶标发现新工具。

 

Nature Communications：肠道微生物脆弱拟杆菌改善小鼠肾纤维化

肾脏纤维化是慢性肾脏病（CKD）发展至终末期的最终结果，其主要特征包括肾小球硬化和小管间质纤维化。目前，CKD 的治疗包括使用抗高血压药物，如血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素受体阻滞剂，以及采取其他血压控制措施，包括减少蛋白质和盐的摄入。除了透析和手术（即肾移植）外，似乎还没有有效的治疗肾纤维化和终末期肾病的方法。因此，治疗方法的创新是十分必要且重要的。

肠道微生物群与肾脏疾病的关联最近得到了重视，2022 年 10 月 3 日，中国药科大学中医药学院张志浩作为通讯作者在 Nature Communications（IF=17.694）发表了题为「The gut microbe Bacteroides fragilis ameliorates renal fibrosis in mice」的研究论文，该研究发现 脆弱拟杆菌（B.fragilis）通过降低 LPS 和提高 1 , 5 - A G 水平改善肾纤维化，为开发脆弱拟杆菌治疗慢性肾病的潜力提供了必要的基础。值得注意的是，在本研究中，作者使用了汉恒提供的慢病毒成功构建了 SLC5A2 基因过表达 HEK293 细胞稳转株。

接下来让我们看看文章的研究结果：

作者先后从武汉大学人民医院和普陀人民医院各招募了一组 CKD 患者和一组年龄和性别匹配的健康对照，发现 CKD 患者中脆弱拟杆菌的相对丰度显著降低。此外，脆弱拟杆菌的丰度与 BUN 和 Scr 呈显著负相关。因此，作者将重点放在脆弱拟杆菌上，以研究该物种与 CKD 之间的关系。

图 1 慢性肾脏病（CKD）人群中的脆弱拟杆菌丰度

接着作者使用肾纤维化 UUO 小鼠模型，完成了一项口服活的非热杀的脆弱拟杆菌实验，发现脆弱拟杆菌治疗显著改善了其肾脏形态并降低了肾脏指数。免疫荧光显示，波形蛋白的表达明显减少，E-Cadherin 的表达明显增加。Masson 染色显示，肾小管扩张、肾小管萎缩和间质间隙变宽，严重炎性细胞浸润减弱。这些发现共同表明，通过口服灌胃补充活的脆弱拟杆菌能够改善 UUO 小鼠的肾脏纤维化。

图 2 脆弱拟杆菌能够改善 UUO 小鼠的肾脏纤维化

与正常小鼠相比，UUO 小鼠中 TGF-β、Smad2、Smad3 的表达均显著增加，然而在脆弱拟杆菌治疗后 TGF-β、Smad2 和 Smad3 表达的显著减弱。还发现 UUO 导致 Keap1 和 ROS 生成分子（包括 12 Lox 和 Rac1）显著增加。在脆弱拟杆菌治疗后，UUO 小鼠中抗氧化蛋白（Nrf2）的表达显著下调。这些结果表明，脆弱拟杆菌通过抑制 UUO 模型中的氧化应激和 TGF-β/Smad 信号通路来减轻肾纤维化。

图 3 脆弱拟杆菌通过抑制 UUO 模型中的氧化应激和 TGF-β/Smad 信号通路来减轻肾纤维化

有报道称 CKD 患者血清中的 1,5-AG 的水平呈现显著降低。为评估脆弱拟杆菌治疗后的代谢物变化，作者使用气相色谱-质谱（GC-MS）分析治疗前后 UUO 小鼠血清样品，发现用脆弱拟杆菌治疗可以显著上调 UUO 小鼠的血清 1,5-AG 水平。接着作者探究了 1,5-AG 在 UUO 小鼠中的肾保护作用，1,5-AG 的给药显著改善了 UUO 小鼠的肾脏形态，降低了 UUO 小鼠的肾脏指数，并降低了几种促纤维化标志物的水平。此外，1,5-AG 在 UUO 小鼠中激活 Nrf2/Keap1 并抑制 TGF-β/Smad 信号通路。这些结果表明脆弱拟杆菌通过上调 1,5-AG 水平来减轻肾纤维化。

图 4 1,5-AG 减轻 UUO 模型中的肾纤维化

SGLT2 (SLC5A2) 是一种表达于肾皮质的葡萄糖转运蛋白，主要负责从肾小球滤液中重新吸收葡萄糖，接下来，作者在稳定表达 SGLT2 的 HEK293 细胞与野生型（WT）细胞中进行 1,5-AG 的细胞摄取实验。发现在稳定表达 SGLT2 的 HEK293 细胞中 1,5-AG 的摄取量比 WT 细胞高 1.7 倍，这表明 1,5-AG 是 SGLT2 的底物，SGLT2 负责 1,5-AG 的肾重吸收。

图 5 SGLT2 负责 1,5-AG 的肾重吸收

草药能够维持肠道菌群的稳态，作者评估了 14 种草药成分对脆弱拟杆菌的生长调节作用。发现 madecasoside（Mad）促进了脆弱拟杆菌的生长，提高了脆弱拟杆菌的丰度，通过口服 Mad 可以改善肾脏形态和肾脏指数。这些结果表明，Mad 以肠道微生物群依赖的方式保护小鼠免受肾纤维化。

图 6 Mad 以肠道微生物群依赖的方式保护小鼠免受肾纤维化

在这项研究中，作者发现脆弱拟杆菌的减少是 CKD 患者的一个关键特征。此外，作者发现了未被认识的脆弱拟杆菌对 CKD 进展的作用，并进一步证明了脆弱拟杆菌通过上调 CKD 患者中 1,5-AG 水平来减轻肾纤维化。此外，通过体外筛选发现一种中药成分 Madecassosid 可促进脆弱芽孢杆菌生长，显著改善肾纤维化。综上所述，该研究说明了脆弱拟杆菌在肾纤维化恢复中的机制作用，并拓展了脆弱拟杆菌以及 Madecassosid 用于 CKD 治疗的前景。