盘点 4 类同细胞感染的注意事项

在实验过程中我们可能会碰到各种各样的细胞，不同的细胞培养和感染可能会有所不同，像很多细胞系的培养和感染可能会比较容易，但也有细胞比较「娇嫩」，普通的 DNA 质粒根本就转不进去，即使是病毒载体感染，也有不少难题：有些细胞的慢病毒感染能力偏弱，需要多次重复感染；有些细胞本身十分敏感且脆弱，慢病毒感染对细胞的状态影响非常大；有些细胞是悬浮细胞，进一步增大了病毒感染的难度。那么针对不同的细胞我们都有哪些培养和感染注意事项呢？

一、贴壁细胞

贴壁细胞（adherent cells），这类细胞的生长必须有可以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长，繁殖。正常贴壁细胞在培养几天后，会逐渐贴满整个瓶底或者皿底，有的呈纤维状，有的呈多边形。

贴壁细胞相对于悬浮细胞来说，更容易感染，腺病毒和慢病毒均可感染贴壁细胞，感染效率也比较高。贴壁细胞感染步骤可参考汉恒生物慢病毒/腺病毒操作手册。

图 1：慢病毒感染不同贴壁细胞

二、原代细胞

原代细胞（primary culture cell）是指从机体取出后立即培养的细胞。一般把培养的第 1 代细胞与传 10 代以内的细胞统称为原代细胞培养，适合用腺病毒感染。由于细胞增长缓慢，病毒感染效率较低，因此需要进行 MOI 梯度摸索实验，选择适合的 MOI 进行实验，从而提高病毒感染效率（MOI 摸索实验参考第一部分第四小节）。

原代细胞培养和感染注意事项：

1、由于原代细胞增长缓慢，使用腺病毒感染，可以在接种时提高汇合度到 50-60% 左右，确保在感染后 2 天时细胞汇合度达到 90~100%。感染非分裂细胞如神经元细胞，接种后不再增殖，可按照 100% 的汇合度进行接种。

2、若使用慢病毒感染原代细胞，建议接种时细胞汇合度达到 70~80%。感染非分裂细胞如神经元细胞，接种后不再增殖，可按照 100% 的汇合度进行接种。

3、慢病毒感染原代细胞效率较低，若需要构建稳转株使用慢病毒感染，为提高感染效率可使用助转剂 polybrene，但部分细胞对 polybrene 比较敏感，可以用 1-10ug/mL 的范围筛选合适的浓度，以 24h 内细胞无明显毒性反应为佳。也有部分细胞不可添加，需要提前查阅文献资料确认，以免影响后续实验。

图 2：腺病毒感染海马神经元原代细胞

三、原代 T 细胞

原代T细胞较「娇嫩」，针对于此汉恒生物专门研发了对人、小鼠等物种的原代 T 细胞均具有很高感染效率的病毒：汉恒生物小鼠 T 细胞专用逆转录病毒 mTRv 或人 T 细胞专用慢病毒 hTLv，以及对两种 T 细胞效果都比较好的汉恒生物悬浮细胞专用腺病毒 ADS。

原代 T 细胞感染前，需要先进行 CD3/CD28 抗体和 IL-2 刺激激活 48h，再离心换新鲜 T 细胞完全培养基，进行病毒感染。原代 T 细胞为悬浮细胞，需要通过平角离心转染法，先重悬细胞，然后将适量的病毒液加入细胞培养皿后，封好口，放入平角离心机，1000g 离心 60-90min（离心 30min 暂停一次，间隔 10min 继续离心，重复 2-3 次），然后放入培养箱中正常培养即可。若实验条件有限，没有平角离心机，可用离心管代替，将细胞吹打吸入离心管中，进行低速离心，去掉大部分上清，然后加入适量的病毒液，室温放置 15 min（尽量不要超过 30 min，间隔 10min 可以再吹打一次），然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续病毒感染过夜即可。原代细胞不同批次可能会存在差异，病毒感染 MOI 建议进行摸索实验。

图 3：T 细胞专用慢病毒 hTLv 感染人原代 CD4+ T 细胞

图 4：悬浮细胞专用腺病毒 ADS 感染人原代 CD4+ T 细胞

四、其他的一些常见特殊细胞系

①THP-1 细胞

THP-1 是人单核细胞白血病细胞，是一种悬浮细胞。慢病毒感染悬浮细胞步骤可以参考上文。

图 5：慢病毒感染 THP-1 细胞

THP-1 细胞培养和感染注意事项：

1. 换液时需预热培养基；
2. THP-1 细胞对血清要求较高，品质好的血清有利于 THP-1 的生长；
3. THP-1 细胞生长存在密度依赖性，密度较低时，生长较慢，培养密度维持在 2-8×10^5 cell/ml 较合适；
4. THP-1 偏好酸性环境，在偏酸性环境中生长更快，换液一般采取半量换液法；
5. 少量细胞聚团，呈葡萄串状，属于正常现象，特别是细胞密度较低时，易出现这种情况。更换血清品牌或增大血清比例（不超过 20%）有助于解决聚团问题。不建议将聚团的细胞吹散，等待密度高时，会自己分散开；
6. 少量细胞贴壁属于正常情况，将细胞悬液转移至新瓶中即可。当贴壁细胞的比例高于 20%，说明细胞生长环境有异常，需排查培养箱设置、培养基成分，以及培养器皿是否异常。
7. THP-1 推荐 MOI 值 50-200，puromycin 常规剂量 1-2 µg/mL；一般不需要加助转剂 polybrene。

②Jurkat 细胞

Jurkat 细胞是一种常用的人类T细胞白血病细胞系，是一种悬浮细胞。慢病毒感染悬浮细胞步骤可以参考上文。

Jurkat 细胞感染慢病毒的 MOI 以 50-80 为宜，一般不需要加助转剂 polybrene。

图 6：慢病毒感染 Jurkat 细胞

③RAW264.7 细胞

RAW264.7 中文全名为小鼠单核巨噬细胞白血病细胞，属贴壁细胞，最好的形态呈现为小而圆、透亮，但其也极易出现伪足的细胞形态。贴壁细胞感染慢病毒可参考汉恒生物慢病毒操作手册。

图 7：RAW264.7 细胞生长图片

Raw264.7 细胞培养和感染注意事项：

1. RAW264.7 细胞感染慢病毒易分化。慢病毒 MOI 以 10-30为宜，不加助转剂 polybrene。需要每天轻轻吹打细胞，避免贴壁太牢固从而使细胞分化。
2. Raw264.7 传代时不能用胰酶消化，容易导致细胞分化；可以用巴氏管轻轻吹下细胞，或者用细胞刮轻轻刮下。吹打传代操作简单，对细胞培养的新手们更友好，也能更好地控制细胞分化率。
3. RAW264.7 细胞三天不传代更容易分化，很难吹下，每一次接种密度都要控制好；培养过程中一般无法保证 100% 不分化，分化的细胞贴壁性比未分化的要强，传代时只要容易吹下的细胞就可；吹打的力度一定要轻，切勿暴力吹打。

图 8：分化的 RAW 264.7 细胞形态

④C2C12 细胞

C2C12 细胞是小鼠成肌细胞，属于贴壁细胞，分化很快，形成可伸缩的肌管并生成特征性的肌蛋白。用骨形成蛋白 2(BMP-2) 诱导 C2C12 细胞，会导致 C2C12 细胞的分化途径从成肌细胞转换为成骨细胞。贴壁细胞感染慢病毒可参考汉恒生物慢病毒操作手册。

图 9：慢病毒感染 C2C12 细胞

C2C12 细胞培养和感染注意事项：

1. C2C12 细胞需感染后再诱导分化，分化后不增殖，可以生长 2 周以上；
2. C2C12 细胞推荐 MOI 值 50-400，puromycin 常规剂量 2-4 µg/mL；需要加助转剂 polybrene（推荐浓度 8-10 µg/ml）；
3. 细胞增殖较快，建议感染后及时筛选和完成后续实验；
4. 换液时需预热培养基；
5. 该细胞贴壁松散，操作时尽量轻柔。