从单个小鼠肿瘤样本中分选高纯度、高活性 TIL 细胞亚群的完整工作流程

肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocyte, TIL）以其极强的识别肿瘤的特性已被证明在多种癌症临床治疗中具有巨大潜力。TIL 疗法与 CAR-T 和 TCR 细胞疗法的区别在于，T 细胞不需要经过基因工程的改造，且不同于 CAR-T 和 TCR 疗法只能靶向一个抗原，由于 TIL 细胞疗法是从肿瘤组织中直接分离淋巴细胞，由靶向癌细胞中多种抗原的淋巴细胞组成，因此可以通过多个靶点激发对癌细胞的细胞毒性反应。目前针对 TIL 研究正在如火如荼的进行，然而，一个难题却摆在科研工作者面前，由于 TIL 亚群的细胞数量可能非常低，很容易在分离时丢失 。所以，如何高效分离 TIL 细胞及其亚群是进行该细胞研究和临床治疗的重要一环。

目前，市面上有不同的分离 TIL 细胞的方法，但由于并未针对初始肿瘤材料进行优化，因此只能提供低纯度和低活力的目标 TIL 细胞。此外，这些方法并不能从同一样品中分选出不同的细胞亚群，因此需要更多珍贵的肿瘤材料和进行更多轮的细胞分离及分选过程。德国美天旎生物技术基于其在细胞生物学领域强大而完备的技术平台，提供了一个自动化的完整 TIL 细胞分选工作流程，解决实验瓶颈：即如何将小鼠肿瘤组织高效的分离成单细胞悬液、磁珠预富集 CD45+ TIL 细胞，然后从同一样品中依次分选高纯度和高活性的 TIL 细胞亚群。

分离高纯度、高活性的 TIL 细胞亚群的工作流程

1. 肿瘤分离

利用带有加热装置的八通道全自动组织解离器 gentleMACSTM Octo 和小鼠肿瘤分离试剂盒分离 1g 小鼠肿瘤组织。

2. CD45+ TIL 的免疫磁性预富集

为了提高目标 TIL 细胞的频率及纯度，从肿瘤分离出来的单细胞悬浮液中， TIL 细胞首先通过 CD45 磁珠和 autoMACS®全自动磁性细胞分选仪 被分离出来。

3. 流式细胞分选

MACSQuant® Tyto® 是配备三个激光器的台式流式细胞分选仪，可实现多参数分选，并提供分选 TIL 亚群所需的灵活性。
使用 MACSQuant Tyto，通过对同一样本的两轮分选，从 CD45＋TIL 细胞中分选出两个 TIL 细胞亚群：
第一类（NK 细胞）:CD45+CD11b-， 抗 NKp46+;
第二类（B 细胞）:CD45+CD11b-，抗 NKp46-, CD19+。

4. 流式细胞术分析靶细胞

在 TIL 细胞分选之前和之后，在 MACSQuant® Analyzer 10 上通过流式细胞术对细胞进行表型分析，以评估谱系标记的表达，并确定细胞纯度和细胞活力。该过程使用了 REAfinityTM 重组抗体进行分析，确保无偏倚、可重复的细胞表型分析，并无需进行 FcR 阻断。
实现这个工作流程最重要的条件是 MACSQuant Tyto 细胞分选仪。不同于传统细胞分选仪，使用 MACSQuant Tyto 进行分选的整个过程没有任何细胞的丢失，即所有靶细胞 (阳性细胞收集室) 之外的所有细胞也都被收集在分选盒中 (阴性细胞收集室)，而这些非目标细胞也可以作为下一轮分选另一个细胞亚群的起始样本。在这种技术的支持下，不同的细胞亚群可以从同一个少量的肿瘤样本中进行成功分选，对下游应用及数据分析的准确性提供了更高的保障。

另一优势在于，与基于液滴的流式分选相比，基于微芯片的细胞分选在低压和温和的剪切力下进行，细胞无需经过任何减压或充电过程，可极大的保留分选细胞的功能，为任何下游应用提供性能更加和可靠性更高的细胞。
除此之外，MACSQuant Tyto 整个分选过程在完全封闭的无污染的一次性分选盒中进行，分选过程中不会有气溶胶的产生。因此既可保障不同的分选过程不会发生样品间交叉污染，又可以最大限度的保障实验室操作人员的安全。

实验结果及分析

1. 组织解离器和磁珠分选仪可以为细胞分选提供高纯度和高活力的 TIL 细胞。

小鼠肿瘤组织经分离试剂进行单细胞分离和磁珠分选仪的预富集，可提供纯度高达 81.5% TIL 细胞样本用于随后的细胞分选 (见图 A，经特异性免疫磁性预富集后的 CD45+ 肿瘤浸润性淋巴细胞 , TILs)。
 
2. MACSQuant® Tyto® 细胞分选仪可实现从同一肿瘤样本中连续分离高纯度和高细胞活力的 TIL 细胞的两个亚群：肿瘤浸润性 NK 细胞和肿瘤浸润性 B 细胞。

2.1  肿瘤浸润性 NK 细胞分选

经过预富集所得到的 CD45+ TIL 细胞通过第一轮的分选，可得到纯度高于 96% 且细胞存活率高于 98% 的肿瘤浸润性 NK 细胞 (CD45+/CD11b–/Anti-NKp46+， 见图 B)。
 
2.2  肿瘤浸润性 B 细胞分选

以第一轮分选剩余的非目标细胞 (即非肿瘤浸润性 NK 细胞) 作为起始样本进行的第二轮分选 , 可得到出纯度高于 97% 且细胞存活率高于 99% 的肿瘤浸润性 B 细胞 (CD45+/CD11b–/Anti-NKp46–/CD19+， 见图 C)
 
总结

• 美天旎创新的工作流程实现从新鲜的肿瘤组织中分析微量的 TIL 亚群并特异性的分选出该亚群；
• 基于 MACSQuant Tyto 的温和分选可分选到纯度高于 95% 的 TIL 细胞；
• 使用该方法，TIL 细胞的两个亚群 B 和 NK 细胞可以在六个小时内通过分选获取，这可以最大程度保留细胞的活力，为后续肿瘤免疫研究提供更优质的材料。