大神教你瞬时转染快，准，狠！
吉凯基因
一般情况下，瞬时转染是将 DNA 导入真核细胞的方式之一。在瞬时转染中，重组 DNA 导入感染性强的细胞系以获得目的基因暂时但高水平的表达。转染的 DNA 不必整合到宿主染色体，可在比稳定转染较短时间内（最多一周左右）收获转染的细胞，并对溶解产物中目的基因的表达进行检测。如果过表达基因用质粒，如果敲降用的是 siRNA（在 microRNA 实验中，过表达用的是 mimics，敲降用的是 inhibitor）。通过瞬时转染，将目的基因敲降或者过表达（gain and loss 实验），观察下游靶基因的表达情况，或者细胞表型（phenotype）的变化，例如凋亡，周期，增殖，侵袭，转移等。那该怎么做呢？
一、准备
lipofectamine2000（转染试剂）（避光），Opti-MEMI 减血清培养基（避光），目的基因的质粒或者 siRNA（以 siRNA 为例），细胞，六孔板，培养基，以及一些细胞实验所需的普通物品。
二、步骤
细胞接种：
转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞密度应达到 60%～80% 覆盖。
细胞转染：
- 一般六孔板液体每孔在 2ml 左右，不宜太多，或者太少。取两个 1.5mlEP 管，记为 A 管，B 管，每个 EP 管加入 250ul Opti-MEM I，然后 A 管加入 5-10ul lipofectamine 2000，B 管加入 100pM-200pM 的 siRNA（见买来的 siRNA 说明书），然后静置 5min，混合在一起，静置 20min，用 AB 混合液加入到 1.5ml 的无血清培养基 C 内，混匀；
- 将六孔板里的细胞的液体吸出，用 PBS 清洗两遍；
- 将 ABC 混合液 2ml 加入六孔板中；
- 4~6h 后换成正常血清培养基（忌放抗生素），在培养箱内培养；
- 48h 后提取 RNA 或者 72h 提取蛋白，或者 48h 后进行后续相关实验。
三、流程图
四、答疑
- 师兄， 转染为什么不能加抗生素？
答：抗生素，比如青霉素和链霉素，一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂（Opti-MEMI）增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低下。所以在转染的时候不允许加入抗生素。
- 师兄，转不进去怎么办？
答：有以下几种情况：
1）转染 siRNA 设计的靶点不好，一般情况下公司都是三保一，所以有一些确实存在敲不下来，或者过表达的质粒太长，例如基因长度大于 4000bp 的一般过表达效率不高。
2）这些质粒或者 siRNA 过期了。
3）转染的时间太短，或者 siRNA 或者质粒给的浓度太低，可以延长转染的时间，例如 4~6h 换液，改成 8h 换液。或者加大质粒或者 siRNA 浓度，例如之前给以 5ul，现在可以加 7.5 或者 10ul。
- 师兄，转进去细胞全死了？
答：是不是细胞状态不好，还有可能 lipofectamine2000 给多了，建议降低浓度，例如之前加了 10ul, 现在改成 7.5ul 或者 5ul。还有可能是转染时间太长了，降低转染的时间。
- 师兄，48H 提蛋白行不行。
答： 可以的，48H（从转染的时刻开始计时）后基因就都表达了，所以是可以的。
- 如何看转染效率，师兄？
答：如果你买的是带 GFP，或者 RFP 荧光的质粒或者 siRNA，可以在 48h 后在荧光显微镜下观察，可以用发亮的程度代表转染的效率，但是最终还是要用 PCR 或者 western 验证效率。
