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献给初学者:大神教你瞬时转染快,准,狠

丁香园

6402

一般情况下,瞬时转染是将 DNA 导入真核细胞的方式之一。在瞬时转染中,重组 DNA 导入感染性强的细胞系以获得目的基因暂时但高水平的表达。

转染的 DNA 不必整合到宿主染色体,可在比稳定转染较短时间内(最多一周左右)收获转染的细胞,并对溶解产物中目的基因的表达进行检测。

如果过表达基因用质粒,如果敲降用的是 siRNA(在 microRNA 实验中,过表达用的是 mimics,敲降用的是 inhibitor)。

通过瞬时转染,将目的基因敲降或者过表达(gain and loss 实验),观察下游靶基因的表达情况,或者细胞表型(phenotype)的变化,例如凋亡,周期,增殖,侵袭,转移等。那该怎么做呢

01 实验前准备

lipofectamine2000(转染试剂)(避光),Opti-MEMI 减血清培养基(避光),目的基因的质粒或者 siRNA(以 siRNA 为例),细胞,六孔板,培养基,以及一些细胞实验所需的普通物品。

02 步骤

1)细胞接种:转染实验前天接种细胞,各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞密度应达到 60%~80% 覆盖。

2)细胞转染:

1.一般六孔板液体每孔在 2ml 左右,不宜太多,或者太少。取两个 1.5mlEP 管,记为 A 管,B 管,每个 EP 管加入 250ul Opti-MEM I,然后 A 管加入 5-10ul lipofectamine 2000,B 管加入 100pM-200pM 的 siRNA(见买来的 siRNA 说明书),然后静置 5min,混合在一起,静置 20min,用 AB 混合液加入到 1.5ml 的无血清培养基 C 内,混匀;

2. 将六孔板里的细胞的液体吸出,用 PBS 清洗两遍;

3. 将 ABC 混合液 2ml 加入六孔板中;

4.4-6h 后换成正常血清培养基(忌放抗生素),在培养箱内培养;

5.48h 后提取 RNA 或者 72h 提取蛋白,或者 48h 后进行后续相关实验。

03 实验流程图

04 答疑解惑

1.师兄, 转染为什么不能加抗生素?

答:抗生素, 比如青霉素和链霉素, 一般 对于真核细胞无毒, 但阳离子脂质体试剂(Opti-MEMI)增加了细胞的通透性, 使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性, 导致转染效率低下。所以在转染的时候不允许加入抗生素。

2.师兄,转不进去怎么办?

答:有以下几种情况:

1)转染 siRNA 设计的靶点不好,一般情况下公司都是三保一,所以有一些确实存在敲不下来,或者过表达的质粒太长,例如基因长度大于 4000bp 的一般过表达效率不高。

2)这些质粒或者 siRNA 过期了

3)转染的时间太短,或者 siRNA 或者质粒给的浓度太低,可以延长转染的时间,例如 4-6h 换液,改成 8h 换液。或者加大质粒或者 siRNA 浓度,例如之前给以 5ul,现在可以加 7.5 或者 10ul。

3.师兄,转进去细胞全死了?

答:是不是细胞状态不好,还有可能 lipofectamine2000 给多了,建议降低浓度,例如之前加了 10ul, 现在改成 7.5ul 或者 5ul。还有可能是转染时间太长了,降低转染的时间。

4.师兄,48H 提蛋白行不行。

答: 可以的,48H(从转染的时刻开始计时)后基因就都表达了,所以是可以的。

5.如何看转染效率,师兄?

答:如果你买的是带 GFP,或者 RFP 荧光的质粒或者 siRNA,可以在 48h 后在荧光显微镜下观察,可以用发亮的程度代表转染的效率,但是最终还是要用 PCR 或者 western 验证效率。

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