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蛋白质组学研究思路以及发表案例

吉凯

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蛋白质组作为重要的科研技术,广泛应用于科研中,在每年数万篇论文中发挥重要作用。如何利用组学工具快速切入临床科学问题形成科研思路,为我们的研究提速?可参考以下三种研究思路:

6.1、IF 1-3 分文章蛋白质组学+差异蛋白

  • 蛋白质组学检测
  • 筛选差异蛋白进行表达量验证
  • 分析差异蛋白,对差异蛋白进行 GO 和 KEGG 分析

6.1.1、案例影响因子 IF=2.2

iTRAQ-based quantitative proteomics analysis of immune thrombocytopenia patients before and after Qishunbaolier treatment.

科学问题:确定齐顺保利尔(QSBLE)治疗免疫血小板减少症(ITP)的潜在治疗靶点。

研究内容

蛋白质组学:利用蛋白质组学对 ITP 病患者(对照 3 重复,治疗有效、无效病人治疗前后各 3 重复),治疗在 QSBLE 治疗前后的蛋白质表达差异进行分析。与对照组相比,共鉴定出982种差异表达蛋白。与治疗前相比,治疗后 61 种蛋白表达差异,其中 48 种蛋白显著上调,13 种蛋白下调。29 条差异途径显著富集。

差异蛋白验证:Q6N030 和其他蛋白质是蛋白质通路网络中的关键成员,并挑选了 20 种与免疫相关的蛋白质,采用 RT-PCR 和 WB 进行验证,研究证实经 QSBLE 处理后,ITPs 中 MIF、PGK1 和 IGHM 上调。

6.1.2、案例影响因子 IF=2.977

Hippocampal proteomic analysis reveals activation of necroptosis and ferroptosis in a mouse model of chronic unpredictable mild stress-induced depression.

科学问题:在抑郁症中已经发现了神经元丢失,但其机制尚未完全了解。利用蛋白质组分析探索这种病理变化的潜在机制。

研究内容

模型评估:慢性不可预测的轻度应激 (CUMS) 处理小鼠 2 个月。对其抑郁样和焦虑样症状的行为评估以及认知症状的行为评估,表明抑郁症模型建立成功。

蛋白质组分析:对抑郁症和健康组照模型小鼠的海马区组织进行蛋白质组分析,海马体中的 4625 个蛋白质被鉴定,4046 个蛋白质被定量。与对照组相比,CUMS 组在 1.5 倍变化 (> 1.50 或 < 0.67) 和 p 值 < 0.05 的基础上获得 47 个差异表达的蛋白质。在这些显著改变的蛋白质中,27 个蛋白质被上调,20 个被下调。对显著失调的蛋白质进行对其进行 GO、KEGG、亚细胞定位分析。其中最显著富集的 KEGG 途径是矿物质吸收、坏死性下垂、基底切除修复、系统性红斑狼疮和铁下垂。

差异蛋白验证:免疫荧光证实,与对照组相比,海马 CA1 和 DG 亚区的神经元损失显著。对 RIP3、MLKL 和 p-MLKL 及与铁稳态失调和脂质过氧化相关指标,包括 Ftl1、MDA、GSH 和 GPX4 等进行 WB 验证,结果表明铁死亡和坏死与慢性应激诱导的抑郁有关。

6.2、IF 3-5 分文章蛋白质组学+代谢组学

  • 蛋白质组学和代谢组学检测
  • 分析差异蛋白,对差异蛋白进行 GO 和 KEGG 分析;分析差异代谢物,对其进行 KEGG 分析
  • 蛋白质组+代谢组数据整合
  • 对关键通路中的蛋白进行验证

6.2.1、案例一影响因子 IF=3.509

Small intestine proteomics coupled with serum metabolomics reveal disruption of amino acid metabolism in Chinese hamsters with type 2 diabetes mellitus.

科学问题:2 型糖尿病(T2DM)是一种以高血糖症为特征的代谢紊乱,伴有代谢紊乱,胰岛素抵抗(IR),其机理研究通常是基于啮齿动物模型。中国仓鼠有自发性 T2DM 非肥胖动物模型的特征,用于研究糖尿病发病机理和分子机制的潜在价值。

研究内容

模型评估:中国仓鼠是 T2DM 的自发模型,从三个月大的血糖变化开始,在 12 个月大时开始患上糖尿病。比较糖尿病仓鼠和非糖尿病的对照组,结果显示糖尿病仓鼠空腹血糖(FBG)水平高于对照组,OGTT 结果显示,在 30min 时,糖尿病仓鼠糖耐量明显受损。

蛋白质组分析:对糖尿病仓鼠小肠组织样本进行蛋白质组学分析,对 213 个差异蛋白进行亚细胞定位、COG 和 GO 分析。差异蛋白质中的大多数在翻译后修饰、蛋白质周转、伴侣和氨基酸转运以及代谢中起作用。

代谢组学分析:同时对糖尿病仓鼠的血清进行代谢组学分析,并对差异代谢物进行 KEGG 分析,谷胱甘肽代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成以及精氨酸和脯氨酸代谢通路发生显著异常。

组学联合分析:KEGG 关联分析揭示甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径表现为甘氨酸、高丝氨酸、色氨酸、前列腺素 AM1、磷酸葡萄糖脱氢酶、磷酸丝氨酸转氨酶、CTH 发生上调,综合分析结果进一步表明,糖尿病仓鼠的氨基酸代谢途径是异常的。

差异蛋白验证:对氨基酸代谢途径中的 PGAM1, PHGDH, GATM, CTH 与 CBS 的蛋白表达含量明显上调,这与蛋白质组学结果一致。

6.2.2、案例影响因子IF=6.551

Integration of proteomics and metabolomics reveals promotion of proliferation by exposure of bisphenol S in human breast epithelial MCF-10A cells.

科学问题:双酚 S (BPS) 与双酚 A (BPA) 具有相似的雌激素效应。考虑到 BPS 的内分泌干扰效应,本研究采用基于质谱的代谢组学和定量蛋白质组学方法,研究了 BPS 对正常人乳腺上皮细胞株 MCF-10A 的影响。

研究内容

表型实验:暴露于 BPS 达 24 小时后,MCF-10A 细胞的增殖以一种刺激的方式发生改变,在剂量为 1μM 时增殖率最高。

蛋白质组分析:总共有 200 种蛋白质被鉴定为在暴露于 BPS 1 微米后发生了显著变化。表皮生长因子受体 (EGFR) 和 Ras/mTOR 相关蛋白的上调表明 EGFR 介导的途径参与了 BPS 诱导的 MCF-10A 细胞增殖。此外,发现几个增殖相关蛋白标记物升高,如 MKI67 和 CDH1,进一步表明低剂量 BPS 暴露促进增殖。

代谢组分析:35 种内源性代谢物也发生了显著变化。对改变的代谢物和蛋白质的联合途径分析表明了三羧酸 (TCA) 循环、嘌呤代谢、丙酮酸代谢和脂质代谢途径的改变,这些途径涉及维持细胞增殖和细胞信号转导。

6.3、IF 5-10 分文章蛋白质组学+细胞/动物实验

蛋白质组学检测

分析差异蛋白,对差异蛋白进行 GO 和 KEGG 分析

筛选差异蛋白进行表达量验证

对验证过的差异蛋白进行表达量干扰

细胞学实验

动物学实验

6.3.1、案例影响因子IF=5.6

Proteomics identifies EGF-like domain multiple 7 as a potential therapeutic target for epidermal growth factor receptor-positive glioma.

科学问题:利用蛋白质组学方法探讨表皮生长因子 -EGFR- 血管生成轴在胶质瘤发生中的作用,并探讨司美替尼对胶质瘤的治疗效果。

研究内容

蛋白质组分析:对 10 例 EGFR 阳性和 10 例 EGFR 阴性胶质瘤病例的肿瘤组织样本进行蛋白质组分析。蛋白质组学发现 EGFL7 在 EGFR 阳性的胶质瘤组织高表达,利用公共数据库的全基因组测序数据,对 EGFL7 表达量进行验证,并与预后关联。

细胞水平上:特异性敲除了 U87-MG 和 U251-MG 细胞中的 EGFL7。免疫荧光结果显示沉默 EGFL7 的细胞系中 EGFL7 蛋白信号较弱。CCK-8 检测显示 U87-EGFL7kd 和 U251-EGFL7kd 显著抑制细胞增殖。

动物水平上:裸鼠分别注射 U87-MG 细胞、U87-EGFL7kd 细胞、U87-MG 细胞+司美替尼治疗。EGFL7 敲除组与司美替尼治疗组的颅内信号强度在肿瘤细胞注射后第 14 天显示出肿瘤体积的差异。小鼠生存分析和免疫组化染色表明,司美替尼有效抑制 U87 胶质瘤的生长小鼠颅内肿瘤标本中 ERK 和 PKM2 表达均与 EGFL7 表达呈正相关。

6.3.2、案例二影响因子:IF=9.77

KIF5A-dependent axonal transport deficiency disrupts autophagic flux in trimethyltin chloride-induced neurotoxicity.

科学问题:三甲基氯化锡(TMT)在工业和农业领域中广泛用作杀菌剂和塑料稳定剂的组成成分,普遍被认为具有有效的神经毒性,尤其是在海马神经元细胞中。然而,TMT 诱导神经毒性的机制仍然不清楚。

研究内容

表型实验:通过 CCK-8 分析确定 TMT 在 Neuro-2a 细胞中的神经毒性。用 2μM、4μM 和 8μM TMT 处理细胞 24 小时分别导致细胞活力降低约 15%,31% 和 44%。

蛋白质组分析:确定了 8μM TMT 处理组和对照组的蛋白质表达谱。与对照组相比,TMT 组中共有 340 种差异蛋白,其中 204 种蛋白上调,136 种蛋白下调,进一步研究表明 TMT 破坏了自噬体的清除,导致它们在细胞质中的积累。IPA 显示出对 KIF5A 信号通路的抑制与自噬相关蛋白显著相关,并且 KIF5A 通过与 GABARAP、GABARAPL1 和 GABARAPL2 的相互作用而成为自噬通量的重要调节剂,因此假设 KIF5A 可能是参与自噬通量调节的关键因素。

细胞水平上:KIF5A 过表达明显恢复了 8μM TMT 处理的 Neuro-2a 细胞的细胞活力。PRM 靶向蛋白分析技术显示 Kif5a 过表达可恢复 tmt 处理的 neuro2a 细胞中自噬相关蛋白的水平。KIF5A 过表达可有效挽救 TMT 诱导的轴突运输缺陷。

动物水平上:腺相关病毒 (AAV)-KIF5A,并通过尾静脉注射给小鼠。过表达 KIF5A 的小鼠明显减轻了癫痫发作症状和海马损伤。同时,KIF5A 过表达也减少了 LC3B-II 的积累并增加了海马中的 CTSB 活性。

常见问题与答疑


1、保存几年的样本还能不能做蛋白质组和代谢组?

如果保存的样本是基于统一的收样原则,与吉凯基因样本收集指南上的要求相符,且未反复冻融的,即使是保存好几年的样本仍是可以进行蛋白质组学或代谢组学检测。

如果客户比较谨慎,可建议客户每组送几例样本过来预实验(价格和正式实验一致),通过质检(蛋白有,代谢无)、检测数量、PCA 分析等情况综合判断这批样本的质量及组间组内波动。

2、组织样本需要 PBS 清洗吗?

如果组织样本上有明显的血液残留,可以用 PBS 清洗干净,用吸水纸吸干再保存;如果组织样本上没有血液残留,则可省略 PBS 清洗的步骤。注意:血液残留是会对检测结果有影响的。

3、样本是否一定要液氮速冻?

液氮速冻是瞬时降温,而 -80℃ 是缓慢降温的过程。原则上有条件的情况下,建议液氮速冻,这样可以保证样本离体后最短的时间内蛋白质组、代谢组达到一个稳定的状态。对于需要保存好几年的样本,最好液氮速冻;若没有液氮,仅需保存 1-2 年的样本,可立即放 -80℃ 冰箱保存;仅需保存 1-2 个月的样本,可放 -80℃ 或者 -20℃ 冰箱保存。

4、全血可以做蛋白质组学和代谢组学吗?

全血不做蛋白质组学和代谢组学,一般都是血清、血浆或分离各类血细胞再进行组学检测。蛋白质组学研究中,通常不建议选用全血样本,因其含有血细胞,而血细胞破裂后释放出的物质会改变血清和血浆的成分,从而影响检测结果的准确性。

5、血浆和血清哪个做蛋白质组学比较好?

蛋白质组学检测本身对这两类样本没有偏好性,都可以检测,而已发表的文献中这两类样本都有使用。具体选什么,可以根据客户实际情况,或者参考这个疾病研究领域更多人选择哪个类型的样本进行选择。需要提醒的是,客户的一个研究,从蛋白组学检测到验证,尽量保持样本类型的一致性。

6、外泌体可以做蛋白质组学的哪些项目?

外泌体样本可以做 4D label free、DIA(DIA 2.0 和大样本 4D-DIA)和 4D 磷酸化蛋白质组学。由于外泌体抽提得到的蛋白量相对较少,除非客户特别要求且蛋白量充足,否则小样本量的时候,都建议优先推荐 4D label free,而不推荐 TMT。

7、冻存久了的血清、血浆抽提外泌体做蛋白质组学有啥风险?

目前有报道称,和从新鲜血清、血浆中抽提的外泌体相比,从冻存久了的血清、血浆抽提的外泌体其形态变化差异不大,但外泌体相关标志物蛋白会明显减少,这也意味着可能存在其他内容物蛋白的减少。因此,请尽量使用新鲜的血清、血浆样本抽提外泌体进行相关实验。

8、石蜡样本(FFPE)是否可以进行蛋白质组学?

可以做。样本数量少的情况下(如 30 例以下),选 4D/480 Label free;样本数量 ≥ 30,可以选择大样本 4D-DIA(性价比高)。样本收集要求如下:

(1)【推荐】以石蜡块形式保存的样本进行常规切片操作,切片厚度 5-10μm,≥15 片/样本。

(2)石蜡块儿:≥1mm 厚度;

(3)固定在玻片上的切片(白片,未经任何染色),≥15 片/样本。

检查样本无污染,妥善包装后,常温寄送。

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