经验分享｜生物发光成像标记物选择

生物发光是一种依赖于酶和底物的相互作用来产生光的化学过程。所需的酶被称为荧光素酶，底物因荧光素酶的类型而不同（如荧光素）。

常用荧光素酶信息表：

其中最有代表性的是来自萤火虫体内（Firefly）和海肾（Renilla）体内的两类萤光素酶，分别命名为萤火虫荧光素酶（FLuc）和海肾荧光素酶（RLuc），同时近年来研究得较多的是来源于高斯氏菌的高斯荧光素酶（GLuc）。

萤火虫荧光素酶（FLuc）作为最通用和最常见的报告基因，该蛋白质不需要翻译后修饰即可获得酶活性，可用于原核和真核细胞。FLuc和其它甲虫荧光素酶是分子量相对较大的酶，分子量大小约为 60kDa，底物为 D-荧光素，需要辅助因子 ATP 和 Mg²⁺。FLuc 发出的是黄红光，发射光峰值为 560nm。

海肾荧光素酶（RLuc）是一种从 Renilla reniformis 分离的分子量大小为 36 kDa 的荧光素酶。与 FLuc 相比，海肾荧光素酶的底物和辅助因子需求不同。RLuc 在氧气存在下催化腔肠素，产生 480 nm 的蓝光。海肾萤光素酶因其与 FLuc 在底物要求和光输出方面的差异而可用于双重报告检测。

近年来，因为其它荧光素酶分子量相对较小，且不需要 ATP 参与反应，使用有所增加，比如来源于高斯氏菌的高斯荧光素酶（GLuc）分子量仅约为 20 kDa，比荧光蛋白还要小，因此被用作甲虫荧光素酶的替代或补充，用于细胞基础和动物成像研究。GLuc 作为一种不依赖于 ATP 的分泌酶，也使用和 RLuc 相同的底物——腔肠素。腔肠素有着明显的缺点，限制了其在动物成像研究中的使用。腔肠素在血清中会被氧化，产生高水平的背景发光，从而干扰对培养细胞和活动物的成像信号的检测。GLuc 表现出闪光动力学，信号会在 1 分钟内下降约 70%。GLuc 突变体则具有更持久的类发光动力学，腔肠嗪必须通过静脉或心脏内注射系统注射进行动物成像，这极大地限制了动物的吞吐量。最后，GLuc 发出蓝光，峰值为 480 nm，限制了组织在体内成像的穿透。特别地，GLuc 在表达后，可有效从哺乳动物细胞中分泌出来，因此可以通过检测量化细胞培养基中荧光素酶活性。

NanoLuc 荧光素酶（NLuc）是一种来源于深海虾的新型荧光素酶，其分子量只有 19 kDa，可从哺乳动物细胞中分泌出来，也不需要翻译后修饰。不依赖于 ATP，底物为 Furimazine。特别是，NLuc 在催化底物 Furimazine 时不需要 ATP 参与，就能够产生辉光型发光，为成像提供了更宽的时间窗。Furimazine 是专门针对 NLuc 优化的腔肠素类似物，具有更高的稳定、更低的背景以及更高的发光效率，因此在难转染的细胞中也能获得较好的表现。