生物发光标记法

一、材料准备

1.  动物：裸鼠9 只，6～8周龄，雄性；C57小鼠24 只，6～8 周龄，雄性；动物均为自由饮水采食。

2.  细胞：MDA-MB-231人乳腺癌细胞系，使用荧光素酶基因标记。方法：用荧光素酶报告基因标记的质粒转染人乳腺癌细胞， 共转染的还有选择性标记基因，从而保证转染 细胞的稳定性，形成表达荧光素酶的肿瘤细胞株；B16 黑色素瘤细胞。

二、实验步骤

1.  紫杉醇混合胶束的制备

（1）将适量紫杉醇溶解在少量无水乙醇和丙二醇的混合溶剂中.

（2） 加入适当比例的磷脂和表面活性剂A 进行充分混合，制得稳定的紫杉醇混合胶束前体制剂，载药浓度为6 g/L。

（3）临用时按剂量加入生理盐水中稀释、摇匀后即可使用。制剂体系的粒径大小与分布特征采用动态激光光散射粒度仪检测。

2.  MDA-MB-231人乳腺癌细胞荷瘤鼠模型的建立

（1）培养荧光素酶基因标记的MDA-MB-231人乳腺癌细胞系，使用DMEM 培养基（添加 10%胎牛血清），37 ℃、5% CO2 培养箱中培养，每3天传代1次。

（2）待细胞密度为80%～90%、细胞总量达到实验所需要求时，使用胰酶消化，收集于PBS溶液重悬。

（3）如有需要，在细胞培养一定时间后，应使用抗生素 Zeocin进行抗性筛选，  保证荧光素酶基因的表达量足够。

（4）收集细胞，使用PBS稀释至细胞数1.5×10⁸/mL，接种于裸鼠腋下，每只裸鼠的接种量为0.1 mL 。

3.  动物活体成像检测

（1）接种后将裸鼠随机分为3组，分别为生理盐水组、紫杉醇注射液组、紫杉醇混合胶束制剂组，每组3只。

（2）肿瘤接种后第8天开始给药，剂量为 15 mg/kg，每3天腹腔注射给药1次。从第1次给药开始，每7天进行1次活体成像检测。

（3）采用戊巴比妥对裸鼠进行麻醉（剂量为 60~80 mg/kg），  10~15 min 后裸鼠即处于昏迷状态。

（4）腹腔注射荧光素底物（150 mg/kg），发射光波长在540~600 nm。注射后15~35 min 观测，为荧光强度最高的时段。

4.  活体成像仪参数设置

（1）将2~3只小鼠并排放入暗室中，荧光素酶与底物反应后产生的发光不需要激发，可以自发光，只需调整CCD相机的曝光时间拍照即可。

（2） 选用3 min 曝光时间，使用软件Kodak MI In Vivo Fx Pro处理图像，增加伪彩。

（3）观察肿瘤区域的影像，并根据活体成像图片测量图中肿瘤大小，进行统计分析。

5.  在整个实验过程中，给药的同时监测裸鼠体重，采用游标卡尺测量肿瘤大小，运用公式V = π•（6ab2）-1计算肿瘤体积， 绘制肿瘤生长曲线，并与活体成像结果进行比较，考察紫杉醇制剂的抑瘤效果以及利用活体成像方法评价药物抑瘤作用的可行性和准确 性。

6.  生存周期的测定

（1）在活体成像实验的基础上，研究不同紫杉醇制剂对B16黑色素瘤C57小鼠的生存期的影响。

（2）首先培养B16黑色素瘤细胞，以PBS调整细胞数至5×106/mL。采用右后肢皮下注射，每只C57小鼠注射0.1 mL，即细胞数为5×10⁵。

（3）接种后常温下正常饮食饲养，于肿瘤接种后第6天，肿瘤直径达0.2 cm 左右时，随机将C57小鼠分成3组，分别为生理盐水组、Taxol 组、PMM 组，每组8只。

（4）采取腹腔注射给药法，每隔3天给药1次，给药剂量为15 mg/kg。

（5）每天观察小鼠，以天为单位记录死亡时间并绘制生存周期曲线，并计算平均生存周期。

7.  统计学方法所有统计的实验数据以x ± s表示，采用SPSS软件对比较的样本进行 t 检验。