Nature 正刊带你解锁单细胞测序对肿瘤免疫治疗的新思路

众所周知，肿瘤一直都是众多科学家难以攻关的难题，肿瘤军团和免疫军团的战争也从未停歇。人体本身的免疫军团时刻保持警惕，尤其是人体自身免疫系统，为了一举歼灭善于隐藏的肿瘤细胞，同时防止自己滥杀无辜，设下多种作战方式：① T 细胞重新找出肿瘤细胞（CAR-T 疗法）；② 不受阻碍全力追击肿瘤细胞（免疫检查点抑制剂）。但仅靠免疫系统自身斗争还是有些困难，因此通过体外基因改造的嵌合抗原受体 T 细胞（CAR-T）疗法开始发挥作用，而叠加 CRISPR/Cas9 基因编辑技术 buff，形成的非病毒的定点整合 CAR-T 疗法就是最强武器。该治疗复发难治性非霍奇金淋巴瘤的临床试验结果表明：87.5%（7/8）的患者获得疾病完全缓解，5 例无癌生存已超过 1 年，首例接受治疗的患者已无癌生存 2 年！

1.文章介绍

论著题目：Non-viral, specifically targeted CAR-T cells achieve high safety and efficacy in B-NHL

发表期刊：Nature

影响因子：69.504（2022 年最新数据）

2.实验基础信息

单细胞捕获平台：烈冰生物 10X Genomics 平台

生信数据分析平台：NovelBrain^® 生信分析系统

数据分析工具：细胞聚类分析，Marker gene 鉴定，GSEA 分析，Qusage 分析等

3.实验设计

（1）非病毒定点整合 CAR-T 细胞的制备

首先，为提高大片段 CAR 序列在 T 细胞中的整合效率，团队通过大量实验摸索和优化，发现以同源臂长度为 800bp 的线性双链 DNA 作为模板，可获得最好的 CAR-T 整合效果，并利用 AAVS1 位点进一步制备了靶向 CD19 的定点整合型 CAR-T 细胞（AAVS1-19bbz）。与慢病毒感染 CAR-T 细胞（LV-19bbz）相比，尽管电穿孔过程会导致一些细胞损伤，但并不影响 CAR-T 细胞的增殖和高细胞活力，AAVS1-19bbz 均能在体外和小鼠体内杀伤肿瘤细胞，证明了制备非病毒定点整合的CAR-T 细胞的策略是可行的。

（2）非病毒 PD1 定点整合 CAR-T 细胞对肿瘤杀伤力

基于多项 PD1 敲除可以有效增强 CAR-T 细胞功能的前置研究，团队将目光聚焦到开发非病毒 PD1 定点整合 CAR-T 细胞上来（PD1-19bbz），希望获得增强型的非病毒定点整合 CAR-T 细胞。实验发现在 PD1 位点，CAR 序列的整合效率为 20% 左右（最高 30.3%），且 PD1-19bbz 细胞的增殖能力要优于 LV-19bbz，PD1 下调并不会影响 CAR-T 细胞行使肿瘤杀伤功能。

为了充分了解 PD1-19bbz 细胞的特性，团队使用慢病毒和 CRISPR-Cas9 技术制备了 PD1 敲除的 CAR-T 细胞。将其与 LV-19bbz、AAVS1-19bbz 和 PD1-19bbz 三组对比发现，PD1-19bbz 的 CAR 表达水平与其他样本组相似，但 PD1-19bbz 细胞对高表达或低表达 PD-L1 的肿瘤细胞表现出更强大且持久的杀伤效果，小鼠生存率得到显著提高，说明 PD1 敲除与非病毒定点整合 CAR-T 细胞制备方法可以联合提高抗肿瘤功能。

（3）临床试验评估该方案安全性和有效性

在此基础上，研究团队开展了研究者发起的临床试验以评估该方法治疗复发难治性非霍奇金淋巴瘤（r/r B-NHL）的安全性和有效性：8 例接受治疗的患者中，未观察到 CAR-T 治疗相关的神经毒性和 2 级以上的细胞因子风暴，其中 7 名患者（87.5%）在治疗后的观察期内实现了疾病的完全缓解（CR），有 5 名患者出现持久反应，PD1-19bbz 细胞在体内增殖并持续存在，所有患者的最佳客观缓解率为 100%。值得注意的是，PD1-19bbz 在回输剂量和阳性率较低的条件下也显示出良好的疗效，表明非病毒 PD1 整合的 CAR-T 细胞对 r/r B-NHL 具有很高的安全性和有效性。

（4）单细胞测序为全面了解治疗前后状态的变化提供支持

为了进一步了解非病毒 PD1 整合的 CAR-T 细胞的特性，团队利用不同方法制备了 CAR-T 细胞并进行了单细胞测序，对 10 个样本（分组详见下图 a）中获得的63789 个细胞进行了深入分析，通过 CD8+ 记忆和功能障碍/细胞毒性 marker gene 将其分为 2 大类群，从记忆和功能障碍/细胞毒性基因表达情况来看，非病毒基因特异性靶向（PD1-19bbz、AAVS1-19bbz）的细胞中 CD8+ 记忆细胞百分比更高。与 AAVS1-19bbz 细胞相比，PD1的敲除使 PD1-19bbz 细胞具有增强的免疫反应能力。

为探究 PD1-19bbz 细胞在回输前后的特性，团队进一步对 3 例患者不同治疗时间节点的 9 个临床样本也进行了单细胞测序并获得 54774 个细胞，数据分析结果显示：回输后 CD8+CAR+ 细胞中记忆细胞相关基因持续表达(如 SELL、CD27 等），某些细胞功能障碍相关基因表达减弱（如 ITGAE、CD38 等），说明回输后存续的 CAR-T 细胞倾向于维持记忆性细胞的状态。

此外，免疫反应相关的多个基因在预后好的患者样本中富集；基因集富集分析 (GSEA) 表明，PD1 低表达的 CAR+ 细胞具有更高的增殖和免疫反应能力，这为全面了解 PD1-19bbz 回输前后状态的变化并解释其临床表现提供了数据支持。

Summary

研究团队利用 CRISPR/Cas9 基因编辑系统,在不使用病毒载体的情况下成功制备了靶向 CD19 的 PD1 下调定点整合型 CAR-T 细胞，并通过临床试验证明了其临床治疗的安全性和有效性。进一步结合单细胞测序技术，证实了非病毒 PD1 定点整合 CAR-T 细胞具有更高比例的记忆性 T 细胞和更强的免疫反应能力。本研究对推动 CAR-T 技术的发展具有重大意义。

图：PD1 定点整合 CAR-T 细胞（红色）正杀灭肿瘤细胞（深蓝色）；

未编辑的 T 淋巴细胞（绿色）无法有效杀伤肿瘤细胞（亮蓝色）

文章图文来源：烈冰生物