第一视角带你了解单细胞测序技术对植物领域模式生物的剖析

随着新一代测序技术的快速发展，更多生物学领域开始应用单细胞测序技术。单细胞转录组测序技术可以全面真实的揭示细胞的多样性和复杂性，尤其是在单细胞分辨率下对于样本的转录本信息进行研究，可以完美的解决细胞异质性问题。但在植物研究中由于细胞壁等因素的限制，相关研究稍显缓慢。2022 年 2 月 NEW PHYTOLOGIST 在线发表了一篇水稻花序单细胞文章，对水稻花序组织中细胞的分化发育进行了全面剖析，首次揭示了水稻花序组织发育过程中的细胞异质性和分化发育轨迹。该研究是以烈冰生物 CTO 宗杰博士为一作发表的文章，烈小冰将以第一视角为大家解析该文研究思路和分析结果。

1.文章介绍

论著题目：A rice single cell transcriptomic atlas defines the developmental trajectories of rice floret and inflorescence meristems

发表期刊：NEW PHYTOLOGIST

影响因子：10.323（2022 年最新数据）

2.实验基础信息

实验分组:

采用水稻花序早期发育各生殖分生组织转换、花器官属性建立等发育过程的样本：S1（＜2mm花序）：S2（2-3mm花序）：L（剑叶）=2：2：1

实验平台：BD Rhapsody^TM

数据分析平台：NovelBrain^® 生物信息分析云平台

分析工具：聚类分析，marker gene 鉴定，GOPathway 分析，拟时序分析，Qusage 分析

3.研究成果解析

（1）水稻花序细胞异质性分析

利用 NovelBrain^® 生物信息分析云平台，烈冰生信专家团队对 37571 个高质量细胞的单细胞转录组数据进行了无偏聚类分析，共划分为 16 个群体（Cluster）并利用单细胞浏览器对 t-SNE 图进行了可视化展示（图 1a），随后，我们基于 AUROC 分析（图 2b）、皮尔森相关性分析和细胞占比统计等多种方法，证明 S1 和 S2 两个重复样本中细胞群体高度一致和数据的可靠性。

进一步，基于已报道的 marker gene，烈冰团队绘制了 heatmap 图，同时联合基于 GSEA 的 QuSAGE 分析（图 1c）和细胞占比统计（图 1e）等多种方法，将上述 16 个细胞簇鉴定为小穗、分生组织、叶和花序轴四大细胞类群。为了获得不同类群的准确功能偏好，烈冰团队整合了包括 TAIR、IRGSP 等多个植物学注释数据库，构建了水稻和拟南芥的本地 GO、pathway 数据库，并以此进行了全面准确的基因富集分析。结果显示：与“细胞分裂”相关的基因在分生组织细胞中富集、与“花发育”相关的基因在小穗组织细胞中富集，这些结果表明了水稻花序早期发育中存在高度的细胞异质性。

（图 1c）

（图 1e）

（2）花细胞亚群的发育轨迹分析

水稻花序组织复杂，不同细胞类型之间异质性大，因此需要对同类细胞进行细分分类，以获得更精细的解析结果，这也是遇到复杂组织时的常见分析策略。在对花细胞进行了细分分群（图 2a）过程中，烈冰团队结合已报道的 marker gene 对各个簇进行了细胞类型鉴定（图 2b），得到了包括外稃、内稃、浆片和雄蕊在内的该时期全部已知水稻花器官，还发现了小穗属性细胞（SIC）、花分生组织（FM）、边界细胞（boundary）、隐性苞片（cryptic bract）等新的细胞类群。研究发现，WOX 类转录因子 DWT1 在 FM 中高度富集表达，基于该生信分析结果，研究团队使用遗传学方法进一步分析了 DWT1 对花序的影响（图 2e,f），即 DWT1 参与花序的发育，调控水稻 FM 的活性，这也是 DWT1 与花发育功能相关的首次报道。

（图 2b）

利用 monocle 算法的拟时序分析，我们重建了花细胞亚群的两条发育轨迹：生殖器官（FM、pa、lo、st 等花组织）轨迹和非生殖器官轨迹（cb、le、sl, rg 等苞叶类附生组织），并证明“真正的”水稻花序包含 SIC、FM、pa、lo 和 st 等器官，而rg、sl、le 不属于花。还通过表达模式分析并结合已有文献的报道，发现 ROC/HDG 家族基因高度富集的 SIC 细胞群处于 SpM 和 FM 的表皮层，这也得到了原位杂交的验证（图 3c）。

（图 3）

（3）花序分生组织异质性分析

同样的策略下，烈冰团队对分生组织进行了深入分析，将其分为花序分生组织（IM）、分枝分生组织（BM）和小穗分生组织（SM）三大类群，并用拟时序分析重建了分生组织的发育轨迹：IM 会向 BM 或 SM 转化。在此基础上，我们又对细胞分化的关键节点进行了 BEAM 分析，将控制侧生分生组织转变的调节因子分为了 4 类；同时在利用激素通路相关的基因集合对 BEAM 分析的结果进行扫描时，发现不同激素对水稻花序分生组织属性转换时所起的精细调控作用。

（4）OsAUX1 促进初级分枝伸长

基于 BEAM 分析结果，交大研究团队深入分析了生长素转运蛋白 OsAUX1 的表达模式和生物学功能，证明 OsAUX1 主要影响花序和分支，并为生长素调控水稻花序发育提供了直接的遗传学证据。

Summary：

水稻，作为植物领域的模式生物，其研究意义十分重大。水稻花序发育决定产量，并依赖于腋生分生组织（AMs）的活性，然而，已有文献对水稻花序早期发展的高分辨率分析却十分缺乏。因此，在本研究中，使用高通量单细胞 RNA 测序分析了 37571 个水稻花序细胞，并构建了涵盖早期生殖发育过程中花序到小花的过渡的基因组尺度基因表达资源。重建小花和 AM 的分化轨迹，鉴定高度异质的幼花序中的离散细胞类型和调节因子群，然后通过原位杂交和荧光标记系进行验证。通过分析早稻花序发育的综合转录组图谱，在遗传证据的支持下，为 AM 分化和小花发育提供了单细胞水平的见解。

文章图文来源：烈冰生物