如何设计条件性基因敲除小鼠模型

小鼠和大鼠可谓是生命科学实验室里的明星，成功的小鼠和大鼠模型可谓是 「生命科学的好帮手」。很多人想自己设计或是了解条件性基因敲除小鼠，此文供参考。

条件性基因敲除小鼠的设计利用了 Cre/LoxP 或 Flipe/Frt 原理。它们都是位点特异性重组 酶系统。这里以 Cre/LoxP 系统为例。比如在待敲除的一段目标 DNA 序列的两端各放置一个 loxP 序列，得到 flox(flanked by loxP) 小鼠。将 flox 小鼠与带有细胞特异性表达 Cre 的小鼠交配繁殖，以获得在特定细胞里把目标基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。此外，若与控制 Cre 表达的其他诱导系统 (比如 CreERT2) 相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。

Cre/loxP 系统来源于噬菌体，可以介导位点特异的 DNA 重组 。该系统含有两个组成成分：一个是一段长 34bp 的 DNA 序列 (LoxP 序列)，含有两个 13 bp 的反向重复序列和一个 8 bp 的核心序列。 LoxP 的方向由中间这 8 个碱基决定。这段 LoxP 序列是 Cre 重组酶识别的位点。

另一个组成部分是 Cre 重组酶。它是由噬菌体编码的一种由 343 个氨基酸组成的蛋白。Cre 可以介导两个 LoxP 位点的重组，从而引起两个 LoxP 之间 DNA 序列的缺失。如果将 Cre 重组酶 cDNA 通过基因工程的手段置于组织或细胞特异性启动子之下，可以得到 Cre 组织 / 细胞特异性表达的 Cre 小鼠，也叫 Cre 工具小鼠。 跟 Flox 小鼠交配之后，可以得到条件性基因敲除小鼠。

所谓 Flox 小鼠是指在某个基因的某个外显子两侧各放一个 LoxP 序列。这段序列就是 Flanked by LoxP，也就叫做 Flox 小鼠。这种 Flox 小鼠一般要通过设计构建打靶载体、胚胎干细胞重组 、囊胚显微注射、和嵌合体小鼠传代来获得。这种小鼠跟 Cre 工具小鼠交配，由于 Cre 的表达，介导两个 LoxP 位点序列的重组，从而敲除两个 LoxP 之间的序列。由于不同 Cre 工具小鼠的 Cre 表达有组织 / 细胞特异性，就可以达到在不同组织、细胞里特异性敲除目的基因的目标。比如上皮细胞、胸腺细胞、T 细胞、B 细胞、心肌细胞、肠道、肺脏等。

那如何设计条件性基因敲除小鼠呢 ?

这里所说的设计主要是 Flox 小鼠的设计。所谓条件性敲除，是说除了特定细胞外，其它细胞里面没有任何的基因表达异常。一般情况下，不要在第一个外显子前面放置 LoxP 序列。因为第一个外显子前面一般是启动子。放置 LoxP 序列有可能会破坏或改变启动子活性。

条件性敲除一般是敲掉最早引起移码突变的外显子。这样的话，最好不要敲除有起始密码子 ATG 的外显子。否则的话，基因可能会利用 ORF 内的 ATG 编码一个缺少部分 N 端序列的蛋白，这个蛋白很可能有全部或部分野生蛋白的功能。

在选择要敲除的外显子的时候 (各放一个 LoxP 在一个外显子的两侧)，该外显子的碱基数目不能是 3N，否则新基因 pre-RNA 拼接得到的 mRNA 不能产生移码突变。会产生一个与野生蛋白相比少了一段中间序列的新蛋白。

如果一个外显子的碱基数目是 3N+1 或 3N+2，敲除这个外显子之后会产生移码突变，就可以达到基因敲除的目的。筛选要敲除 (Floxed) 的外显子的时候，一般是从最上游的外显子开始筛选适合敲除的外显子。

需要注意的是，一般的 DNA 分析软件 不能确定内含子和外显子的边界，需要仔细核对。95% 以上的边界遵循 gt/ag 边界原则。也可以在 Ensembl 上查一个基因的外显子和内含子。这个网站上的结果绝大部分是正确的。但也需要仔细核对。

毕竟基因敲除小鼠研发是一个时间比较长的过程，需要特别小心。这些原则只是对一般课题的考虑。特殊情况需要特殊处理。比如，如果只是想敲除一个基因的某个特定 domain，或是如果一个基因有一个很大的外显子，这个时候即使这个外显子的碱基数目是 3N，也可以对其进行敲除。