张锋团队再获新进展！Nature 发文解析「超迷你」核酸酶 IsrB 结构及 DNA 切割机制

科学界一直致力于使 CRISPR 基因编辑工具小型化以适应如腺病毒相关病毒（AAV）的递送载体。然而，通过结构引导或定向进化使 RNA 引导核酸酶小型化的尝试都不是特别成功。因此，科学家把目光投向了自然界中未被开发的小型基因编辑工具。

在张锋团队 2021 年发表的 Science 论文中，发现了一类广泛存在的由 IS200/605 转座子超家族编码的核酸酶（包括 IscB，TnpB 和 IsrB），统称为 OMEGA 系统（Obligate Mobile Element Guided Activity），这些核酸酶的体积约为 Cas9 大小的 30%，具有极大的改造潜力。

图片来源：Science

2022 年 10 月 12 日，张锋实验室继续在 Nature 期刊发表了题为 Structure of the OMEGA nickase IsrB in complex with ωRNA and target DNA 的研究论文，分析了脱硫弧菌 DtIsrB-ωRNA 和靶 DNA 的复合物的冷冻电镜结构（分辨率 3.1 Å）及 DNA 靶向切割的分子机制，为下一步对 IsrB 的开发和改造提供了理论基础。

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像 IscB 和 Cas9 一样，IsrB 含有一个 RuvC 样核酸酶结构域，该结构域被桥螺旋结构截断。IsrB 长度仅有约 350 个氨基酸，相比 IscB（Cas9 的祖先）缺少 HNH 核酸酶结构域，同时也缺失 Cas9 的 REC lobe（参与靶标识别）和 PAM 序列互作域。作者推测 IsrB 通过 ωRNA 形成的复杂的三元结构来弥补 REC 的作用。

IsrB 还含有一个 N 端 PLMP 结构域（以其保守的氨基酸基序命名）和一个未表征的 C 端结构域。PLMP 结构域具有四链反平行 β 片和 α 螺旋结构，其结构类似于翻译起始因子 3（IF-3）的 N 端结构域。TAM 相互作用结构域和 RuvC 结构域协同定义了 IsrB 的活性位点。

图：IsrB-ωRNA-靶 DNA 复合物的低温电镜结构（来源：Nature）

OMEGA 使用 ωRNA 作为引导来指导 DNA 的直接切割。这些转座子移动时会产生新的引导 RNA，允许酶在其他地方切割 DNA。IsrB 与 300-nt ωRNA 相关联，其指导 IsrB 切割含有 5'-NTGA-3' 相邻基序（TAM）的双链 DNA。

DtIrsB ωRNA 结构模型（来源：Nature）

ωRNA 驱动异源双链识别：上层与下层 RNA 螺旋相互作用，并广泛地与切口模块（PLMP/RuvC/TI 结构域）通过 S2，SL4 和 SL7 间的衔接子假结相互作用。PLMP 结构域与 ωRNA 3′端附近的串联发夹（SL7 和 SL8）相互作用。截短 SL7/8 而不截短 SL8 降低了 IsrB 的切口活性。

作者推测，ωRNA 结构基序对 ωRNA/RECL 的 DNA 感应别构调节和 RuvC 核酸酶结构域的 DNA 切割活性是重要的。

DtIsrB 通过氢键和范德华力相互作用的组合识别非靶链中的 TTGA 靶标相邻基序（TAM），改变这些相互作用可以扩展 TAM 偏好。编码导向衔接子区域（RNA 的 5′-茎区）对细菌基因组中的 IS200/IS605 转座子活性是重要的，但不是 IsrB 切割靶 DNA 所必需的。作者截短了这个区域的 SL1（ΔSL1ωRNA），发现所得的 RNA 仍然支持 IsrB 的 DNA 切割活性。

IsrB 的 DNA 靶向性和切割机制（来源：Nature）

为了追踪从 IsrB 到 Cas9 的蛋白质结构域进化，作者比较了 IsrB 的结构与已知最大 IscB 和 Cas9 的结构。

除了在 IscB 中包含 IsrB 缺失的 HNH 结构域，作者还观察到其他区域的差异：一些 IscB 的 RECL 比 IsrB 中的相应接头区域大，并折叠成最小的二级结构，而 Cas9-1 的 REC 区域中存在大的球状结构域。OgeuIscB 中的 RuvC 结构域包含几个较大的环，而在 YnpsCas9-1 的 RuvC 包含长的插入及高度结构化的结构域。Cas9 RuvC 结构域的扩大伴随着 PLMP 结构域的丢失。

SpCas9 包含一个更大的 PAM 相互作用域，其中包含一个位于公共核心 PAM 相互作用域下游的额外球状区域。在 Cas9 中 ωRNA 减小并分裂成双 RNA (如 tracrRNA-crRNA)，伴随着 REC 结构域的获得和 Cas9 的所有结构域的整体扩大。

在下图中，祖先 RuvC 核酸酶向 IsrB 和 Cas9 进化的结构决定因素以彩色显示。其中，Cas9 取代 DtIsrB ωRNA 中 SL2 的 REC2 部分（深灰色部分）。

IsrB 进化模型（来源：Nature）

值得一提的是，美国康奈尔大学可爱龙团队于 2022 年 5 月在 Science 发表了一篇文章，其中解析了 IscB-ωRNA 的结构及其切割 DNA 的机制。

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这些新系统将帮助我们了解 RNA 引导系统是如何起源进化的，并为开发更多种类的可编程工具铺平道路。