Cell Rep：上海科技大学季泉江团队开发出高效微型 CRISPR-SpaCas12f1 基因编辑系统

CRISPR-Cas 系统是目前最常用的基因编辑工具，但是由于传统的 Cas 核酸酶分子量普遍太大，使其在在体基因治疗的应用中受限。近年来，为了解决这一难题，小的 Cas 核酸酶逐渐被发现和探究。其中，Cas12f 核酸酶是目前最紧凑的 CRISPR 效应核酸酶，比传统 Cas9 和 Cas12a 核酸酶小一半以上，在临床治疗应用中具有巨大潜力，然而高效的 Cas12f 基因编辑系统仍旧较少。

2022 年 9 月 27 日，上海科技大学季泉江教授团队在 Cell Reports 发表了题为 Guide RNA engineering enables efficient CRISPR editing with a miniature Syntrophomonas palmitatica Cas12f1 nuclease 的研究论文。

该论文报道了 Syntrophomonas palmitatica Cas12f1（SpaCas12f1）的生化特征及 DNA 切割机制，证明 CRISPR-SpaCas12f1 系统能在细菌中实现多种编辑目的，且通过工程化向导 RNA 使该系统转化为哺乳动物细胞中高效的基因组编辑器。来自 Syntrophomonas palmitatica 的紧凑型 SpaCas12f1 只有 497 个氨基酸，该研究首先系统地表征了 SpaCas12f1 的生化特性及对 DNA 识别与切割的模式，证明了 SpaCas12f1 是一种镁离子依赖的嗜热核酸酶，可在 tracrRNA 和 crRNA 的帮助下有效切割含有 5'-NTTY (Y 代表 C 或 T)PAM 的双链 DNA。此外，SpaCas12f1 拥有与 AsCas12f1 相似的切割模式，即在靶向链上引入一个切口，非靶向链上引入两个切口（图 1）。

图 1. CRISPR-SpaCas12f1 的表征与改造

由于 SpaCas12f1 在大肠杆菌中拥有质粒干扰活性，为探究其能否成为一个在细菌中高效的基因组编辑工具，研究人员通过引入 SpaCas12f1 和 Lambda Red 重组酶系统及单链修复模板，实现了 CRISPR-SpaCas12f1 在大肠杆菌（Escherichia coli）和肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）中多种精准的基因组编辑。同时，研究人员发现 SpaCas12f1 的 tracrRNA 具有独特的 head-to-toe 的发夹结构，这是限制 SpaCas12f1 在哺乳动物细胞有效编辑的主要因素。通过对 RNA 二级结构预测及小 RNA 测序结果分析，研究人员设计了五种策略，系统地工程化向导 RNA，成功地获得了高效的引导 RNA，gRNA_MS13，从而实现 CRISPR-SpaCas12f1 高效哺乳动物细胞编辑。

这项研究扩展了微型 CRISPR 核酸酶工具库，并为基因治疗和工程化微型 CRISPR 系统提供了新的思路。