高效但不可预测的CRISPR

随着基因组工程技术的不断发展，利用长DNA模板建立条件小鼠模型成为可能。Lydia Teboul, BMC生物学的一项新研究的作者，解释了这些长模板如何也可以被用来创建远离目标位点的点突变，但是额外的不必要的修改使得新的突变的验证变得至关重要。

从历史上看，实验室动物的基因组工程领域一直依赖于使用干细胞来定位小鼠的新突变。这一切都被允许研究人员直接在胚胎和组织中工作的基因组编辑工具改变了。从简单的突变开始，为了引入越来越复杂的基因变化，策略正在进化。

目前这些技术改进的基础是CRISPR/Cas9系统，它革新了我们在胚胎中直接产生靶向突变的能力，并与单链DNA供体结合使用。虽然寡核苷酸供体(研究人员提供的短DNA模板)在早期文献中已被证明可以促进编辑，但较长的单链DNA供体的使用是基因组编辑工具箱中较新的内容。由于这些较长的供体在将突变引入基因组特定位置方面的适用性和成功性，这种方法被称为“Easi”。

扩大模拟突变的范围

在我们最近发表在《英国医学委员会生物学》(BMC Biology)上的研究中，我和同事们同意这些发现，并对其进行了扩展。我们提出了使用长单链捐赠者在高通量设置产生条件敲除突变。

我们还利用长单链模板来促进远离活性Cas9/sgRNA复合物识别位点的点突变的引入(这到目前为止还不可能)。因此，我们扩大了点突变的范围，这是可以实现的技术。

这种策略在人类基因组测序工作中发现突变的情况下特别有用，因为它扩展了我们在小鼠中复制人类突变的能力。

有害影响比以前认为的更频繁

我们还描述了使用长链单链捐赠者的结果的不可预测性。我们证明，除了序列完美的、目标整合外，该系统还可能产生一系列错误的等位基因。这些包括非预期的点突变，小或大的序列重排，其中一些可能基于局部微同源性，和额外的供体整合。

这些事件是不可预测的副产品，必须排除在验证新建立的突变系的过程中。重要的是，这些不必要的事件比大肆宣传的CRISPR/Cas9试剂的潜在脱靶效应要频繁得多。

虽然我们最近的研究侧重于使用长链单链供体，但我们和其他研究人员此前已经发现，仅使用CRISPR/Cas9试剂或与寡核苷酸结合使用会导致不可预测的事件。因此，越来越多的证据表明，模型验证是基因组编辑社区面临的最新挑战。毕竟，基于基因组编辑突变体的研究的质量和可重复性完全取决于对该突变体的彻底描述。

验证新的突变系是必要的

这些观察结果决不是贬低这个系统的价值。它们只是说明了对新突变体进行全面验证的重要性，包括对基因座的测序和对供体序列整合拷贝数的计数。当我们等待更多的工具来确保获得预期的基因组编辑结果的准确性时，我们必须记住，尽管不可预测，现有的策略在产生受欢迎的突变体方面仍然是有效的。

继续说,很明显,那些参与基因组编辑领域有许多障碍需要明确:1)的认识和理解系统的不可预测性(镶嵌性,单基地变化,重组,额外的集成)应该传播,强调研究社区;2)应制定公认的突变体验证和记录标准;3)制定策略以提高只产生期望的目标结果的机会，这仍然是基因组编辑的圣杯。

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