细胞冷冻技术再升级！Nat Med：胰岛存活率可提高至 90%，糖尿病治愈迎来新希望

导读

至今，距离胰岛素发现已有 100 年之久，糖尿病检测和治疗方法也得到了发展，如连续血糖监测仪、胰岛素泵等，但这些仍然不是彻底治愈疾病的手段。

近几十年来，胰岛移植作为一种潜在的糖尿病根治的方法已经取得了重大进展，但该方法的主要局限来自单个供体的移植往往不足以实现受体的胰岛素独立供应，而解决供体供应问题的一种策略是集中来自多个供体的胰岛，通过一次注射获得高剂量的胰岛，从而提高疗效、降低风险。但是胰岛 β 细胞的保存难以超过多天，限制了这种实验性疗法的使用。

超低温储存，可以实现活细胞和组织的长期储存和现货供应。其中，一项占领导地位的技术叫做 「玻璃化」（vitrification），即将生物材料快速冷却到玻璃态（glassy state，或称混凝态）。目前，玻璃化技术也已被人体冷冻公司应用于人脑的冷冻保存。但器官的低温保存技术仍然存在难题，如解冻过程中会产生结晶，对组织细胞造成损伤，使其破裂。截至目前，还没有一项公开发表的技术能够在临床可应用的方案中同时实现胰岛低温保存和恢复后的功能行使。

近日，为了实现这一目标，来自明尼苏达大学的研究团队建造了一种装置，可以测量细胞在冻结时收缩然后膨胀的程度，用来寻找一种冷冻胰岛后不会造成破坏性变形的方法。该研究内容以 Pancreatic islet cryopreservation by vitrification achieves high viability, function, recovery and clinical scalability for transplantation 为题发表在 Nature 子刊 Nature Medicine 上。

图片来源：Nature Medicine

研究人员在对冷冻保护剂的配方、浓度和玻璃化方法进行了系统的研究后，开发了一种新的胰岛低温保存方法，同时实现了胰岛的高回收率、高活力、高功能性。

在该研究中，体内外的实验也证实了这种方法储存的干细胞衍生的胰岛（Stem cell-derived beta cell, SC-beta）细胞的体外活力、代谢健康和胰岛素分泌均较好。同时，使用同基因和异种移植模型，他们证明了在玻璃化和复温后（Vitrification and Rewarming, VR），胰岛在体内仍然存活，并可产生胰岛素，对血糖刺激做出反应，并可最终治愈糖尿病。

主要研究内容

整体策略和流程

在本研究中，他们系统测试了小鼠、猪、人和 SC-beta 胰岛在低温保存和复苏后的功能。其中，小鼠胰岛和 SC-beta 胰岛用于初始策略开发，人胰岛和猪胰岛用于验证该策略。他们首先筛选了玻璃化和复温方法并评估了它们在冷却再复苏和可扩展性方面的性能，紧接着对复苏后的胰岛进行功能性检测和体内模型评估。

图片来源：Nature Medicine

玻璃化-复温（VR）后胰岛的活力和形态特征

研究人员使用优化后的冷冻保护剂配方以及冷却-复温系统，对冷却-复温后的胰岛形态、活力、DNA 片段易位情况进行了评估，并将其与健康活体对照、乙醇处理的死体对照和常规冷冻保存的胰岛进行了比较。

结果表明，玻璃化-复温后的四种胰岛类型（小鼠、人、猪和 SC-beta）的整体外观和活力与新鲜对照胰岛相似，远好于常规冷冻保存的胰岛；常规冷冻保存的胰岛则显示出结构的破坏，而 VR 胰岛边缘光滑，组织学外观正常，与新鲜胰岛非常相似。

在使用透射电子显微镜进行超微结构检查时，这种差异更为明显，VR 胰岛的细胞核内膜、线粒体、分泌颗粒等细胞器完整；相比之下，常规冷冻保存的胰岛细胞外观则有明显的质变，线粒体和分泌颗粒减少，细胞和核膜大量起泡。

图片来源：Nature Medicine

接下来，他们对每种胰岛冷冻保存技术下胰岛的活力变化进行了评估。

其中定性实验显示，VR 胰岛与活的对照胰岛相似，坏死或死亡细胞数量只是略有增加，而常规冷冻保存的胰岛则显示出更多的细胞死亡。

活细胞定量实验结果同样表明，相比于对照组，VR 后的细胞活率约为 90%，即使冷冻保存 9 个月后，细胞存活率也没有显著变化；常规冷冻保存则为 60% 左右的细胞存活率。总之，与传统的冷冻保存相比，本研究所使用的 VR 技术使得被保存的胰岛在细胞活力和形态方面取得了实质性的改善。

图片来源：Nature Medicine

VR 胰岛的体内功能验证

作为冷冻复苏后胰岛功能的最终衡量指标，他们在同基因和异种小鼠移植模型中测试了小鼠胰岛、猪胰岛和 SC-beta 细胞的体内功能。同基因小鼠移植胰岛后 48 小时内就可恢复正常血糖，移植后 60 天更是显示出与对照组胰岛相似的胰岛素免疫荧光染色。

图片来源：Nature Medicine

此外，利用异种移植模型，他们测试 SC-beta 的体内功能，在移植后 4 周、8 周和 12 周随机抽取血清样本测量人胰岛素水平。结果表明，冷冻复苏后移植的 SC-beta 胰岛在 12 周内一直分泌人类胰岛素。此外，在 14 周时，受体小鼠禁食后，通过腹腔注射葡萄糖可刺激人胰岛素的产生，这在传统的冷冻保存的胰岛移植模型中并未观察到。这些结果证实了以这种方法冷冻复苏的 SC-beta 细胞在体内的功能。

图片来源：Nature Medicine

结语

综上所述，在这项研究中，他们首次展示了一种长期保存胰岛的有效方法，同时实现了高活力和胰岛功能的有效恢复。这种新型的冷冻保存胰岛的方法可以彻底改变胰岛分离、分配和移植前存储的供应链，并提高死亡供体胰岛的整体利用率，最终治愈更多的糖尿病患者。

更加有意思的是，本研究中的 VR 方法对干细胞衍生的人类胰岛也有效。SC-beta 替代提供了一种充足供应移植所需胰岛的方法，当研究人员将解冻的细胞群移植到糖尿病小鼠体内时，92% 的小鼠在两天内恢复正常的血糖水平。因此，结合这种新的冷冻保存方案，可以显著改善 SC-beta 的供应链，从而增加糖尿病患者的治疗选择。

这项研究为未来的临床胰岛冷冻保存奠定了基础。这种方法为胰岛移植的广泛应用铺平了道路，具有广阔的应用前景。

2022 年 3 月 18 号，Nature 杂志官网以「亮点研究」对该工作进行了推荐和评价，并刊登了题为 Cold treatment for insulin-making cells points to diabetes cure 的文章。

图片来源：Nature 官网

该评述性文章指出，胰岛移植到糖尿病患者体内具有恢复葡萄糖水平的能力，从而达到治愈疾病的目的，但是胰岛很难保存，从而限制了这种疗法的使用。本研究在测量细胞在冻结时收缩和膨胀的程度后找到了一种低温保存胰岛的方法，而且这种方法不会造成破坏性的结构和功能改变。

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