流式细胞术实验流程

流式细胞技术（Flow cytometry, FCM）是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物，它能有效地从单细胞水平区分异质性细胞群体，检测对象包括但不限于悬浮细胞、贴壁细胞或从实体组织分离的单细胞悬液和其他生物颗粒。

一、细胞表面染色步骤

1. 样本准备

1.1 采集全血或组织（脾，淋巴结，胸腺和骨髓），用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)制成单细胞悬液。对于体外刺激的细胞，直接将刺激后的细胞悬浮在细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)中，然后进行第2步。

1.2 加满细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS), 300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。

1. 红细胞裂解

2.1 如需裂解红细胞（如脾脏），将10x红细胞裂解液(ACK buffer)用去离子水稀释到1x，放置到室温。将细胞重悬于3mL的1x ACK buffer中，室温孵育2-3分钟；如不需要裂解红细胞，直接进入第3步,。

2.2 加入10mL细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)终止红细胞裂解，300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。

2.3 重复洗涤一次，加满细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)至15mL, 300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。

2.4 细胞计数，用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)将细胞制成1x10⁷/mL悬液。将100μL细胞悬液加入2mL EP管中备用。

1. 封闭Fc受体

封闭Fc受体能减少染色过程中的非特异性染色。

小鼠中，纯化的CD16/CD32单抗能和FcγRⅢ/Ⅱ结合，封闭非特异性染色，使阴性细胞的背景荧光降至未标记细胞的水平。加入0.5-1μg纯的抗小鼠CD16/32单克隆抗体，室温孵育10分钟。

对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型的纯化Ig或者相同来源血清进行阻断，或者用商业化的Fc受体阻断剂。

1. 细胞染色

4.1 按照说明书的推荐用量加入荧光标记的抗体，混匀后置于4℃，避光孵育30分钟。

4.2 加入适量细胞染色buffer (或含1%BSA的PBS)重悬细胞，300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。

4.3 加入0.2 mL细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)重悬细胞，用流式细胞仪进行检测和分析。

注意事项

1. 在抗体使用之前，快速离心一下，使之聚集到管的底部。
2. 荧光标记的抗体应该避光4℃保存，不要冷冻。
3. 当染色的时候，固定或延迟分析可能降低某些抗体的荧光信号。为了得到更好的结果，染色后应该马上分析。

二、细胞内细胞因子染色步骤

1. 细胞准备

1.1 收集细胞。经刺激和阻断处理的细胞（具体处理方案请参考文献进行），加细胞染色buffer（或含1%BSA的PBS）制成单细胞悬液，调整细胞浓度约为1 × 10⁷/mL。

1.2 取100 μL细胞/管（约1 × 10⁶细胞），分别加到做好标记的EP管底部。

1. 固定

2.1 如需要表面染色，则先依照“细胞表面染色步骤”选用适宜抗体进行表面染色。

2.2 用1×细胞固定/破膜液（Fixation/Permeabilization buffer），将流式管中的细胞重悬，室温避光孵育30分钟。

2.3 300g离心5分钟，弃去上清。

1. 破膜

3.1 用1×细胞破膜buffer（Permeabilization Buffer）将固定过的细胞悬起，300g离心5分钟，弃去上清。

3.2 重复洗一次，300g离心5分钟，弃去上清。

3.3 加入1 mL的1×细胞破膜buffer（Permeabilization Buffer），4℃避光孵育30分钟；300g离心5分钟，弃去上清。

1. 胞内染色

4.1 用100 μL的 1×细胞破膜buffer（Permeabilization Buffer）重悬细胞，加入相应的抗体，混匀，4℃避光孵育至少30分钟。

4.2 加入2 mL的 1×细胞破膜buffer（Permeabilization Buffer）重悬细胞，300g离心5分钟，弃去上清。

4.3 加入2 mL的细胞染色buffer（或含1%BSA的PBS）重悬细胞，300g离心5分钟，弃去上清。

4.4 加入0.2 mL的细胞染色buffer（或含1%BSA的PBS）重悬细胞，用流式细胞仪进行检测和分析。

注意事项

1. 同一个细胞同时做细胞表面和细胞内的蛋白，建议先做细胞表面染色，再固定、破膜。

2. 细胞内染色推荐使用同型对照。