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人外周血PBMC的制备及注意事项

Elabscience

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人外周血PBMC的制备流程

  1. 收集抗凝人外周血,用 1640 无血清培养基或 PBS 按照 1:1 的比例稀释,上下颠倒混匀或者用移液枪吹打混匀。
  2. 在 15 mL 离心管中,先加入 3 mL 充分混匀的 Ficoll 液(1.077 g/mL),再沿着管壁缓慢加入2 mL稀释后的血液,血液和 Ficoll 液分层明显为成功。

注:Ficoll 提前半小时从 4℃ 冰箱取出恢复到室温,温度过高会导致分离不明显,温度过低会导致密度过大,同样分离效果不好, 20~25℃ 最佳。。

  1. 将样本小心转移到离心机,500 g 离心 25 min。
  2. 小心取出离心管,吸取中间层的白色薄膜层,即为单个核细胞。
  3. 用 10 mL PBS 洗涤获得的单个核细胞,250g 离心 10 min,弃上清。
  4. 重复洗涤一次。
  5. 用细胞染色缓冲液重悬细胞备用。

注意事项:

  1. Ficoll 使用时的温度很重要,温度太高或者太低都会影响分离效果。
  2. 血液样本最好为新鲜抗凝血(采血 2 h 以内),为保持细胞活力,应避免冷冻和冷藏。
  3. 3.50 mL 离心管离心效率比 15 mL 离心管差,为了获得最大量的单核细胞,最好用15 mL离心管,且离心管使用量不要超过三分之一,可以将血样进行等分后加入多个离心管。
  4. 分选后的细胞样本直接诱导阻断进行细胞因子的检测,效果最佳,分选后的样本也可冻存,需要的时候再诱导检测。
  5. 诱导阻断后来不及检测的样本,最好冻存,并在 3 天内检测效果最好。冻存液推荐使用 90% 的FBS+10% 的 DMSO。冻存 24h 再检测,结果无大的影响;冻存 3 天再检测,CD3 和 IFN-γ 表达略有降低;冻存1周后再复苏检测,CD3和IFN-γ表达较大幅度降低。
  6. Ficoll 分离液分离后图片:

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