流式课堂 | 流式对照设置之同型对照

#01 什么是同型对照？

同型对照（Isotype Control），是指与使用的流式抗体具有相同种属来源、亚型、荧光标记物、使用剂量和浓度，但对目标靶点无特异性结合的抗体。同型对照通常用来消除抗体与抗原的非特异性结合造成的背景染色。

#02 为什么要做同型对照？

流式抗体与靶标的结合，是通过抗体的 Fab 端与靶标 Marker 进行特异性结合而完成的。白细胞（除T细胞外）表面大多表达 CD16、CD32、CD64 等 Fc 受体，这些受体可与各种抗体的 Fc 端非特异性结合，出现非特异性染色。其中，以单核细胞、巨噬细胞尤甚。

此外，除 Fc 受体的影响外，在活细胞的表面染色实验中，单核细胞和巨噬细胞均存在吞噬抗体或与荧光染料发生非特异性结合的现象。并且，在多色流式实验中，还存在荧光背景的影响及药物处理的影响，即便对 Fc 受体进行了封闭，在分群不好的情况下，依然需要用到同型对照。此时，同型对照的使用也就十分重要。

实验时，如果仅仅参照空白对照来圈门，就可能出现一部分假阳性结果。如果参考同型对照来区分阴阳性，就能够把这部分非特异性结合造成的假阳性排除。

FcR分子

目标蛋白分子

以 CD45＋白细胞样本为例，在排除了死细胞和粘连体后，未进行染色、也未进行 Fc 受体阻断的空白样本，各通道荧光处于低水平。如图所示：

染同型对照后，背景荧光增强。

针对这种因 FcR 导致的强背景，建议可以添加 FcR 封闭剂，如下图所示：

阻断 FcR 后，染同型对照，背景荧光恢复到与空白相似。

#03 什么时候需要做同型对照？

（1）对于阴阳性分群明显的指标，不需要同型对照即可设门，例如 CD3、CD4、CD8 等用于 T 细胞的检测指标。对于阴阳性分群不清楚的指标，例如 CD25、CD69、CD38 等活化指标，及 IFN-γ、IL-4、IL17A 等细胞因子，则需要设置同型对照，实现阴阳性细胞群的良好区分。

CD4

CD25

（2）在某些特殊情况下，如单核细胞被 PE/Cyanine 7、APC/Cyanine 7 等串联染料标记的抗体染色时，使用同型对照抗体是十分有必要的。单核细胞一般倾向于与 Cyanine7 等染料非特异性结合，使用同型对照抗体有助于获得理想结果。

（3）不清楚抗原表达情况的时候，一定要使用同型对照来界定阴性细胞群。

（4）胞内染色时，因为胞内指标表达量一般不会太高，胞内染色过程也非常容易导致抗原抗体非特异性结合。