流式课堂 | 流式实验对照设置之单阳对照

多色流式实验中，由于不同荧光素的发射波长的覆盖范围不同，可能产生重叠，对实验结果的数据分析造成一定干扰，我们通常会设置单阳管进行调节补偿。同时，单阳管还可以辅助我们调节通道电压，防止信号超出接收范围。

图示：常见荧光素的发射光谱

A. 如何设置单阳管

单阳管即单染管，是只添加一种荧光抗体的样本管。一般来说，实验 panel 有几种荧光，就需要设置几个单阳管。如：APC、PE、FITC 的三色 panel，需要设置三个单阳管。

B. 制备单阳管的要求

①单阳管和全染管的样本类型、荧光素要保持一致；

②单阳管和全染管的样本处理要相同，如：全染管进行了固定破膜处理，单阳管即使是表面因子，也需要进行固定破膜；

③单阳管上机的电压要和全染管保持一致；

④单阳管要保证有足够的阳性细胞群。

C. 单阳对照常见问题

问：目标 marker 表达量高，阴阳细胞分群明显，也需要设置单阳管吗？

答：如果 panel 的指标少，可以不用设单阳管，通过手动调节补偿，将细胞调整到横平竖直的状态即可。但是，如果 panel 的指标比较多，就必须都设置单阳管。

补偿前 ↓

补偿后 ↓

图示：FITC 和 PE 之间存在荧光补偿，但 CD4 和 CD8 细胞分群明显，且整个 panel 只有三色，可以进行手动调节补偿。

问：某些 marker 的表达量比较低，单阳管的阳性群细胞不明显怎么办？

答：在设置单阳管的时候，我们会发现，一些低表达 marker（Foxp3、IL-17A、IFN-γ 等）的阳性群非常少，调节补偿时，软件不能正确识别，甚至识别不出阳性群细胞。这时，我们可以选择该样本高表达的一些 marker（CD3、CD4 等），用相同的荧光标记来代替低表达 marker。

注意事项

► 进行流式配色时，请尽量选择光谱重叠少的荧光素，减少补偿。

► 补偿值一般不会超过 100%。如果出现超过 100% 的情况，可能是串联染料断裂导致；另外，补偿值不会出现负值，如果出现，则表示某些通道存在过补偿。

► 软件自动调节完补偿，可以打开补偿面板，观察一下每个通道的补偿是否合理。若不合理，可以适当进行微调。

► 为了更合理地圈出阴阳群，我们可以先根据 FSC 和 SSC，圈出对应细胞群，这样更有利于调节补偿。

综上，正确且合理地设置单阳管，更便于后续对流式实验结果进行分析。