熬夜不睡，心脏遭罪！生物钟到底如何影响心脏健康，中国科学家给出了新的解释

昼夜节律紊乱，如熬夜不睡、夜班工作，可能会对健康产生多种不良影响。其中，也与心脏疾病的发生有关，目前尚不清楚心脏分子时钟功能障碍是否与自然发生的人类心脏病进展有关。核受体 Rev-erbα/β 是生物钟的关键组成部分，已成为心脏病的药物靶点，但心脏 Rev-erb 的功能在体内尚未得到研究。

2022 年 1 月 17 日，美国德克萨斯州贝勒医学院孙正，中国医学科学院宋江平，和中国温州医科大学附属第二医院等多家单位合作，在 Circulation 上发表了题为 Myocardial Rev-erb-Mediated Diurnal Metabolic Rhythm and Obesity Paradox 的研究性论文，发现心肌细胞中的 Rev-erbα/β 介导正常的代谢节律，使心肌细胞在小鼠休息时间（白天）更喜欢脂质作为能量来源，去除 Rev-erbα/β 会破坏这种节律，降低心肌细胞在休息时间使用脂质的能力，并导致进行性扩张型心肌病和致命的心力衰竭。

图片来源：Circulation

研究内容

Rev-CKO 小鼠出现进行性收缩功能障碍和致死性心力衰竭

Rev-erbα 和 Rev-erbβ 在昼夜节律中具有高度序列同源性。因此，研究者构建了心肌细胞特异性 Rev-erbα/β 双基因敲除小鼠。

超声心动图显示 KO 小鼠在 2.5 月龄时左心室大小、壁厚和收缩功能正常；然而，在 4.5 月龄时，KO 小鼠显示出收缩功能受损，左心室直径增大，但心室壁没有明显增厚；到 6 个月大时，射血分数下降到 20-30%，左心室进一步扩张；雌性 KO 小鼠在 6 个月时也出现类似的收缩功能障碍和心脏扩张。

KO 小鼠的收缩功能障碍与心钠素（ANP）和 B 型利钠肽（BNP）表达升高和心脏明显增大有关。左心室 KO 心脏扩张但无明显纤维化。大多数 KO 小鼠在 6-8 个月大时死亡。总之，Rev-erbα/β 心肌细胞特异性敲除导致进行性收缩功能障碍，导致扩张型心肌病（DCM）和致死性心力衰竭。

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Rev-erb 调节心脏代谢基因的振荡表达

研究者分析了年轻时 KO 小鼠的基因表达，以排除收缩功能障碍的继发影响。在小鼠 2 个月大时，在授时因子时间（Zeitgeber time, ZT, 即由实验室所订的环境时间，在节律研究中人为控制光照）2、6、10、14、18 和 22 时，收集一次心室心脏组织，并在每个 ZT 点上鉴定 KO 和 WT 之间的差异表达基因。

每个 ZT 上大约 25-35% 的差异表达基因是其独有的。常见差异表达基因在所有 6 个 ZT 上的倍数变化也显示出强大的 ZT 特异性差异。上调的差异表达基因在细胞粘附和昼夜节律中富集，而下调的差异表达基因在代谢过程中富集，尤其是脂肪酸氧化，支持 Rev-erb 在心肌能量代谢中的核心作用。

许多参与脂肪酸代谢的差异表达基因，在 WT 小鼠心脏中表现出昼夜振荡，峰值表达围绕着从亮到暗的过渡，在 KO 小鼠心脏中的时间模式被破坏，呈现恒定的低表达水平。相比之下，在参与葡萄糖代谢的差异表达基因中，许多在 KO 心脏中获得了更明显的振荡模式，在暗周期中表达峰值。这些结果表明，KO 小鼠的心脏减少了脂肪酸氧化，特别是在光周期后期，并增强了葡萄糖利用，特别是在黑暗周期后期。因此，心脏 Rev-erb 的生理作用是在光照周期中增强脂肪酸氧化基因，但在暗周期中抵抗葡萄糖代谢基因激活。

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Rev-erb 通过多种方式调控脂肪酸代谢基因

研究者在小鼠 2.5 个月大时，在 ZT9 和 ZT21 两个时间点分离心肌细胞核，并进行 Rev-erbα ChIPseq。ZT9 时心肌细胞中 Rev-erbα 的全基因组结合峰是 ZT21 的五倍。经典 Rev-erb 靶基因 Bmal1 和 E4bp4 在启动子中携带强 Rev-erb 峰。

E4bp4 是 Rev-erb 缺失的心肌细胞中与改变的组蛋白乙酰化标志物具有高度结合相似性的转录因子。E4bp4 是已知的转录抑制因子，也是 Rev-erb 的靶标，在 ZT9 的转录起始位点处具有稳健的 Rev-erbα 峰。E4bp4 表达在 KO 与 WT 心脏中上调。

此外，已知 E4bp4 调节肠道和肝脏中的脂质代谢。这些观察结果促使研究者探索上调的 E4bp4 是否解释了 KO 心肌细胞中下调的脂质代谢基因。在 AC16 心肌细胞中敲低 Rev-erbα/β，下调了脂肪酸氧化基因和脂肪酸氧化通量率，并增加了葡萄糖摄取。与单独的 Rev-erb 敲低相比，Rev-erbα/β 和 E4bp4 的联合敲低挽救了脂肪酸氧化基因的表达和脂肪酸氧化通量。

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心脏 Rev-erb 调节心肌蛋白质组

为了解心脏 Rev-erb 如何调节心肌蛋白含量，研究者在 10 周龄时对 WT 和 KO 小鼠心脏的 ZT6、ZT14 和 ZT22 进行了蛋白质组学分析。在每个样品中检测和量化了超过 4,000 种蛋白质。

在每个 ZT 时，KO 与 WT 相比，上调的蛋白大约是下调蛋白的 3 倍。差异表达的蛋白高度依赖于 ZT，每个 ZT 处只有 17-22% 的差异表达蛋白与其他 ZT 相同。尽管不同 ZT 的差异表达蛋白在单个蛋白质水平上的重叠有限，但它们在能量代谢过程中具有共同的功能富集。这些发现进一步支持心脏 Rev-erb 调节能量代谢的昼夜节律。

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心脏 Rev-erb 调节心肌代谢的昼夜节律

3 个月大的脂质组学分析确定了 180 种脂质，主要是心磷脂和甘油磷脂，在 WT 心脏中显示出强烈的昼夜节律，但只有 28 种脂质在 KO 心脏中保持相同的节律性。除了节律性丧失外，KO 心脏还显示出超过 100 种脂质（主要是甘油脂）的节律性显著增加。这导致了 KO 与 WT 心脏节奏的整体翻转。WT 心脏中的大多数振荡脂质在 ZT10 处的含量高于 ZT22，而 KO 心脏中的大多数振荡脂质在 ZT22 处高于 ZT10。

10 周龄时的代谢组学分析表明，对于短链酰基肉碱和 TCA 中间体，WT 心脏没有表现出太多的振荡。对于长链酰基肉碱和乙酰辅酶 A 下游的 TCA 代谢物，例如柠檬酸盐和乌头酸盐，ZT6 的 KO/WT 差异比 ZT18 更突出，这与光照周期比黑暗周期损害更显著的结果一致。

对于与碳水化合物代谢密切相关的 TCA 中间体，如苹果酸和富马酸，以及一些氨基酸和多胺，ZT18 的 KO/WT 差异比 ZT6 更突出，这与增加的碳水化合物代谢一致。多组学数据的综合分析表明，KO 与 WT 心脏中的氧化脂质代谢总体减少，特别是在光照周期中，糖酵解的相互增加，特别是在黑暗周期中。这些结果表明，Rev-erb 消耗会损害氧化代谢，并在心脏收缩功能障碍之前影响代谢。

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单独的膳食脂质不会影响 KO 小鼠的心脏功能障碍

研究人员提出猜想，如果脂肪酸氧化受损是导致 KO 小鼠对碳水化合物的偏好并导致心力衰竭的原因，则有可能通过提高脂肪酸氧化的能力来减轻其对糖酵解的过度依赖，达到缓解收缩功能障碍的目的。

由于高脂肪饮食可以上调心脏中与 ppar α 相关的脂肪酸氧化基因，并使心脏糖酵解与葡萄糖氧化分离，研究者试图通过从 8 周龄开始饲喂高脂肪无蔗糖饮食来验证这一假设。但与他们的预期相反，5 个月大小鼠的超声心动图并没有显示心脏功能的改善，并且高脂肪无蔗糖饮食没有改变 KO 小鼠心脏中脂质代谢基因或蛋白质的表达。

除了黑暗周期中的膳食脂质外，脂肪分解释放游离脂肪酸作为心脏脂质的另一个主要来源，尤其是在光照周期中。与对照饮食相比，高脂肪无蔗糖饮食仅导致体重、葡萄糖耐受不良、基线胰岛素水平和胰岛素抵抗的 HOMA 指数轻度增加，而不影响血清酮、WT 和 KO 小鼠中的脂肪酸水平。高脂肪无蔗糖饮食下的 KO 小鼠的葡萄糖耐量略有改善，这与过度依赖葡萄糖利用是一致的。这些数据表明，在黑暗周期中增加膳食脂质供应本身，并不能挽救 KO 小鼠的心脏功能障碍。

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肥胖和胰岛素抵抗延迟 KO 小鼠的心脏功能障碍

高脂肪高蔗糖饮食不仅增加了黑暗周期中的膳食脂质，而且在 3 个月后体重增加超过 10 g，还导致更严重的葡萄糖耐受不良、更高的基线胰岛素水平、更高的胰岛素抵抗 HOMA 指数，和光周期中更高的游离脂肪酸。值得注意的是，高脂肪高蔗糖饮食在光照周期中部分逆转了下调的脂肪酸代谢基因和蛋白质，但在黑暗周期中没有。这些结果表明，光周期中增加的游离脂肪酸，上调了脂质代谢基因的表达，可能是通过脂质传感信号通路。

4.5 个月龄小鼠的代谢组学分析显示，KO 与 WT 心脏中的肉碱和 CoA 种类较低，并且在对照饮食中糖酵解中间体和氨基酸含量较高，这与 KO 心脏的脂肪酸代谢受损，和对葡萄糖和氨基酸的过度依赖一致。高脂肪高蔗糖饮食改善以上所有这些 KO/WT 差异。这表明在光循环中，为心肌氧化代谢提供更多的游离脂肪酸，可以部分挽救 KO 心脏中受损的氧化代谢，并缓解生物能量对碳水化合物和氨基酸的过度依赖。总的来说，这些数据支持了多组学分析的观点，并表明代谢紊乱会导致 KO 小鼠心力衰竭。

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总结

本研究通过在小鼠心肌细胞中特异性敲除 Rev-erbα/β 基因，揭示了 Rev-erbα/β 基因如何影响心脏的新陈代谢。

「心脏对不同能量来源的反应不同，具体取决于一天中的时间。在休息阶段，对于人类来说是晚上，而对于小鼠来说是白天，心脏使用从脂肪中释放出来的脂肪酸作为主要能量来源。在活跃期，即人类的白天和小鼠晚上，心脏对膳食碳水化合物有一定的抵抗力。在没有 Rev-erbα/β 的情况下，心脏会出现代谢缺陷，从而在休息时限制脂肪酸的使用，并且在活动期会过度使用糖分」，该研究的共同通讯作者、贝勒大学 Lilei Zhang 博士解释说。

研究人员表示，这项研究具有三个重要的临床意义：

1. 心脏作息与心脏扩张的严重程度相关；

2. 肥胖和胰岛素抵抗是心力衰竭的长期已知临床危险因素，但可以在一定时间范围内保护心力衰竭，这可能是通过提供脂肪酸实现的，即所谓的「肥胖悖论」；

3. 强调了时间疗法的重要性，即根据昼夜节律安排药物，让药物与相应代谢途径的内部昼夜节律保持一致。

Lilei Zhang 说道，「在美国前 100 种处方药中，至少有一半药物靶点与昼夜节律有关。这表明要让这些药物有效，需要在特定时间服用，但现实中几乎没有做到。这项研究强调了在安排药物治疗时，考虑昼夜节律的重要性」。