流式课堂 | 裂红 or 分离液？外周血不同制备方法应用场景

外周血样本采集完毕后，我们需要对其中的待测单细胞进行提取。针对外周血样本，最常使用的样本制备方法有两种：

一. 裂红法

利用红细胞裂解液，去除红细胞

二. Ficoll 法

利用不同细胞的沉降系数差异，进行梯度密度离心，提取 PBMC

两种方法分别在什么场景下应用？接着往下看。

裂红法

裂红法，即裂解样本中的红细胞。血液中的红细胞比白细胞多 10-100 倍，红细胞数量过多，会影响细胞群体的分析。因此，我们在做血液样本检测时，经常需要裂解红细胞。

裂红前

裂红后

01 原理

红细胞表面有专属的表面抗原，当裂解液中含有可以攻击特定红细胞表面抗原的酶，就只会造成红细胞的变形、膨胀、裂解。

02 优点

⊙ 各类型白细胞（淋巴细胞、单核细胞、粒细胞等）保存完整

⊙ 得率高

⊙ 步骤简单，10min 即可

03 缺点

⊙ 对裂红时间要求较高，过长或过短均会影响结果

⊙ 细胞活性低于 Ficoll 法

04 使用注意事项

⊙ 裂解时间过长，也会对其它细胞造成损伤，所以要把握好裂解的时间；

⊙ 做流式检测时，并非所有的血液样本都需要裂红。倘若需要检测的是白细胞（如淋巴、单核、粒细胞等），需要裂解红细胞；倘若检测的是红细胞，不需要裂解红细胞；

⊙ 如果后续样本不用于流式分析，而是需要培养或者冻存复苏，使用裂红后培养的细胞，活性可能会打折扣。

Ficoll 密度梯度离心法

01 原理

根据细胞的沉降系数差异，借助细胞分离液和离心操作，对细胞进行分离。

02 优点

⊙ 获得的细胞更纯净，有利于细胞培养后检测胞内因子

⊙ 可将细胞冻存后再复苏、培养、检测

⊙ 去除死细胞

03 缺点

⊙ 步骤复杂，需 30min 以上

⊙ 取白膜层需要丰富的经验

⊙ 只能获得淋巴细胞和单核细胞，会丢失一部分稀有细胞

⊙ 可能会引起细胞受体激活

分离前

总 结

• 如研究对象是淋巴细胞、单核细胞或粒细胞，且细胞不需要进行培养或冻存，仅进行流式分析时，建议使用裂红法制备外周血样本；

• 如研究对象是淋巴细胞亚群或单核细胞，在做以下实验时，建议使用 Ficoll 法提取 PBMC：

（1）获得的细胞需要继续培养、刺激、阻断或冻存；

（2）研究单核细胞。因为单核细胞只占白细胞的 3-10%，如果使用裂红法，会发现细胞群体太少。为了保证充足的样本量，需要使用 Ficoll 法。