流式课堂 | 粘连体对流式实验结果的影响及排除方法

粘连体，是指两个或更多个细胞粘在一起（大多数是两个）的现象。

理想状态下，细胞是一个一个通过流式细胞仪激光照射区的。细胞通过激光照射区所产生的荧光信号被 PMT 接收，转化成电脉冲信号，如图所示：

从细胞进入激光照射区到离开，电脉冲信号由 0 到达峰值，再降回 0，被记录为一个峰值。H是脉冲高度，代表脉冲信号的峰值，W 是脉冲宽度，是指细胞通过激光照射区域的时间，A 是脉冲信号的面积。

现实情况下，由于各种原因，细胞与细胞会粘在一起，连续通过激光照射区，被仪器认定为一次信号。

当两个细胞挤在一起通过仪器，与单个细胞相比，测量高度不变，宽度和面积变为两倍，即出现 FSC-Height 不变，FSC-Area 和 Width 增大的现象，如图所示：

分析数据时，如果没有排除粘连体，就可能对结果的判断造成误导。举个例子：

如果样本中一部分细胞带有 GFP 绿色荧光，一部分细胞不带荧光，需要分选出带有 GFP 信号的细胞，细胞在缓冲液中的状态，可能会出现以下 5 种情况：

单细胞

粘连体

一个带 GFP 和一个不带 GFP 的细胞形成的粘连体（红框），在没有被排除的情况下，会被默认为是带 GFP 的细胞，从而被流式细胞仪收集。这样，我们实际分析带 GFP 的细胞时，就会掺杂不带 GFP 的细胞到数据中来，使得带 GFP 细胞比例高于实际比例。如果是分选带 GFP 的细胞中，就会被掺入不带 GFP 的细胞，影响所收集细胞的纯度。

既然粘连体会对结果造成这么大的影响，有哪些方法可以在上机时排除粘连体呢？

01.FSC-A 与 FSC-H

一般来说，我们会使用 FSC-A 与 FSC-H 来排除粘连体。如前所述，正常单细胞通过流式细胞仪激光照射区时，H 和 A 是成正比增大的，而粘连体通过时，H 不变，A 增大，因此，可通过细胞的 FSC-A（Area）与 FSC-H（Height）参数完美排除掉粘连体。

02.FSC-H 与 W

由于双粘连体的脉冲宽度大于单个细胞脉冲的宽度，基本达到两倍的关系，所以我们也可以使用 FSC-H 与 W 来排除粘连细胞。因为 H 独立于 W，这种方法不会受到面积的影响，也是非常值得推荐的。需要注意的是，如果检测样本中各种细胞的大小差异较大，此种分析方式可能不太适用。

通过以上方法，可以完美排除掉粘连体，避免粘连体造成的假阳性影响。但是，如果粘连体太多，即使在分析数据时排除掉，对实验结果的影响仍然很大，对仪器管路也不利。因此，在前期样本制备时预防粘连体，才是首选之策。

样本制备时，应注意以下几点，以减少粘连体的发生：

PAY ATTENTION

1. 充分消化并吹散混匀；

2. 样本尽量新鲜制备，特别是组织分离制备的单细胞悬液；

3. 上机前用 200 目筛网过滤；

4. 上机前吹打混匀，勿长时间静置。