施一公团队突破性进展再登 Science！以超高分辨率解析核孔复合物的结构细节

非洲爪蟾（Xenopus laevis）作为一种经典的脊椎动物模型，其胚胎发育过程与人类器官形成过程相似，被广泛地应用于 DNA 损伤应答、细胞凋亡、免疫和炎症反应以及再生和可塑性的研究。

真核生物的细胞核由双层的核膜（NE）包裹，核孔复合物（NPC）在核膜中形成一个通道，用于在细胞质和细胞核之间选择性交换大分子。NPC 是具有 8 倍对称性的圆柱形组件，其组成部分与许多人类疾病有关，包括癌症、病毒感染等。NPC 是真核细胞中最庞大，最复杂的分子机器之一，将 NPC 中的许多蛋白质组装成正确的三维分子结构一直是一个巨大的挑战。

2022 年 6 月 10 日，西湖大学施一公团队在 Science 杂志发表研究论文 Structure of the cytoplasmic ring of the Xenopus laevis nuclear pore complex。

该研究聚焦于非洲爪蟾核孔复合物（NPC）结构，首次扩展了脊椎动物细胞质环（CR）亚单位复合体模型的分子量，获得高分辨率的单粒子冷冻电镜显微结构。除了解析 Y 复合物，同时发现 5 个核孔蛋白 Nup358、2 个 Nup205 和 2 个 Nup93 构成了 CR 的关键组分，揭示了 CR 核孔蛋白间的界面，为展示 NPC 的精细分子结构是如何设计和组装，探索 NPC 的功能和病理过程提供了新的视角！

图 1：来源 Science

核孔复合物的前生今世

核孔复合物（NPC）作为分子量巨大的细胞机器之一，由细胞质丝、细胞质环（CR）、内环（IR）、核环（NR）、核篮（NB）和腔环（LR）组成，其分子量高达 100MDa，因此如何克服技术障碍获取其精细结构，了解其作用机制一直是结构生物学家们的关注点。

在过去二十年中，结构生物学家们将单个核孔蛋白和亚复合体的 X 射线结构与低温电子断层成像重建相结合的综合建模，逐步地增进了人们对 NPC 的了解。

本研究利用单粒子冷冻电子显微镜（cryo-EM）对非洲爪蟾卵母细胞中的 NPC 结构进行探索，结合以往的研究结果，加强了蛋白样品制备，优化冷冻电镜图片的采集，并开发出有效的数据处理策略，获得高分辨率的 NPC 结构。

该结构的核心和 Nup358 区域的平均分辨率分别提高到 3.7Å和 4.7Å，其中核心区域的最高局部分辨率达到 3.3Å。此外，该蛋白结构的 N 端 α-螺旋结构域 Nup358 部分，其分辨率高达 3.0Å。

这无疑是一个振奋人心的研究结构，如此庞大的核孔复合物具有如此之高的分辨率，为了解 NPC 的精细结构打了一剂强心针。

图 2：非洲爪蟾核孔蛋白的细胞质环总体结构示意图

核孔复合物的组装细节

细节决定成败，天下大事必做于细。在结构生物学领域研究中，获得精细的结构便是成功了一半。

当获得了高分辨率的非洲爪蟾 NPC 结构后，发现每个 CR 亚单位具有两个 Y 形多组分复合物，称为内 Y 复合物和外 Y 复合物。CR 中的 16 个 Y 复合体，8 个内部和 8 个外部 Y 复合体，以头到尾的方式组装，以近端和远端同心的形式构建支架。Y 复合体由短臂（Nup85、Nup43 和 Seh1）、长臂（Nup160 和 Nup37）和茎（Nup96、Sec13、Nup107 和 Nup133）组成。

随后，本研究继续将步伐迈向了探索其细节的过程，鉴定了 Nup358、Nup205 和 Nup93 是 CR 支架的组成部分，CR 亚单位模型包含 30 个核孔蛋白中的 19037 个氨基酸。

令人惊讶的是，Nup160 的短臂、长臂分别和 Y 复合体的茎相交。两个相互不接触的 Nup205 利用构象弹性，通过不连续的界面，分别结合内部和外部 Y 复合体。两个 Nup93 均包含一个 N 末端延伸的螺旋和一个 ACE1 结构域，桥接 Y 复合物和 Nup205。Nup93 和 Nup205 共同负责着相邻 CR 亚单位之间的接触作用。五个 Nup358 分子，每个分子的形状形似虾尾巴，因此获名「钳子」，参与维持 NPC 结构的稳定组装。

总之，Nup358，Nup205 和 Nup93 是形成 CR 的关键结构组分，为解释 NPC 在细胞周期中会进行组装和拆卸的机制提供了充分的证据！

图 3：来源 Science

持久且深入的核孔复合物研究

早在 2020 年，施一公团队便将目光投向非洲爪蟾的核孔复合物研究领域，克服巨大的技术障碍，逐步揭开核孔复合物的神秘面纱，从初步确认整体结构再到深入地刻画复合物细节，为研究核孔复合物画上浓墨重彩的一笔！

2020 年 5 月 4 日，施一公团队 (西湖大学为第一单位) 在 Cell Research 杂志发表研究论文 Molecular architecture of the luminal ring of the Xenopus laevis nuclear pore complex，该研究报告了非洲爪蟾卵母细胞的 NPC 的腔环（LR）的冷冻电子断层扫描（cryo-ET）结构。通过单粒子低温电子显微镜（cryo-EM）分析独立确认 LR 的关键结构特征，该研究首次揭示了 LR 以前未知的特征，为解释 NPC 的弹性提供了直观的基础。

图片来源：Cell Research

与此同时，施一公团队（清华大学为第一单位）对非洲爪蟾的核孔复合物的组装和工作细节进行了更为细致的探索，2020 年 5 月 6 日在 Cell Research 杂志发表研究论文 Structure of the cytoplasmic ring of the Xenopus laevis nuclear pore complex by cryo-electron microscopy single particle analysis。

该研究解析了非洲爪蟾 NPC 的胞质环（CR）的单粒子冷冻电子显微镜结构，其整体结构平均分辨率为 5.5Å，包含 Nup358 区域 7.1 Å，Nup214 区域 7.9 Å，局部分辨率达 4.5 Å。在如此高分辨率下，更加清晰准确地将基本的蛋白二级结构和大部分的 CR 组分修入模型当中。

图片来源：Cell Research

2022 年 2 月 17 日，施一公团队在 Cell Research 在线发表题为 Cryo-EM structure of the nuclear ring from Xenopus laevis nuclear pore complex 的研究论文，该研究展示了非洲爪蟾 NPC 核质环（NR）亚基的单粒子冷冻电镜结构，平均分辨率为 5.6 Å。

该研究阐释了 NR 的基本构成，并结合团队之前对 NPC 中胞质环（CR）和内环（IR）的结构研究，搭建了当时最详细、最精确的 NPC 支架结构模型，为领域内理解脊椎动物 NPC 的组成、结构、组装以及功能提供了坚实的基础。

图片来源：Cell Research

同年 3 月 18 日，施一公团队在 Cell Research 在线发表了题为 Cryo-EM structure of the inner ring from the Xenopus laevis nuclear pore complex 的研究论文，展示了非洲爪蟾 NPC 内环 (IR) 亚基的单粒子冷冻电子显微镜结构，平均分辨率为 4.2 Å，揭示了脊椎动物 NPC IR 亚基组装的分子基础。

图片来源：Cell Research

冷冻电镜作为引爆生物学进入新时代的工具，在结构生物学领域发展中立下了汗马功劳，让我们继续翘首以盼，等待更多的超大分子量和高分辨率的蛋白结构诞生，见证实验结构生物学的革命！