提高多色流式实验成功的 8 个 Tips

Tip 1：补偿控制样品必须只染一种颜色

当细胞群同时向两个通道发射荧光时，可能是由于两个原因：

1. 细胞群表达一种 Marker，该标记物被荧光染料偶联的抗体染色，在第二个通道中检测到荧光染料的荧光溢出。

1. 细胞群表达两种 Markers，这些标记物被两种不同荧光染料染色，发射出的荧光到两个通道中。为了在补偿期间排除双阳性细胞的干扰，调节补偿应仅用单一染料染色。

Tip 2：样本中必须包含中位数比较的阴性和阳性细胞群

要正确调节补偿，必须比较溢出通道中阴性和阳性细胞的中位数荧光强度 (MFI)。调整补偿系数后，MFI应该在相同的值。

Tip 3：阴性和阳性细胞必须具有相同水平的自发荧光

如果自发荧光存在差异，则样品可能在实验中被过度补偿。补偿是校正光谱重叠的有效方法，但不适用于适应自发荧光的差异。

Tip 4：替代 Marker 可用于补偿（例如用于稀有细胞应用）

没有必要在对照样品和实验样品中染色相同的 Marker。可以使用不同的 Marker 进行补偿。当阳性细胞很少且适当的补偿需要获取大量细胞时，这一点尤为重要。

Tip 5：使用明亮的 marker 来调节补偿

如果使用替代 marker 来设置补偿，则补偿控制中的标记至少与实验样品中的标记一样亮是至关重要的。否则，可能无法正确调整补偿。通常，暗淡补偿控制不适用于确定精确的补偿值。

Tip 6：补偿控制样品必须包含与实验样品相同的荧光染料

虽然在补偿调节样品中使用完全相同的细胞并不重要，但使用完全相同的荧光染料至关重要。例如，不应使用 FITC 来补偿 GFP。不同形状的荧光染料发射光谱导致光谱重叠的幅度不同，因此需要不同的补偿。

Tip 7：串联荧光染料偶联物需要批次特定的补偿

串联荧光染料对于多色应用是必不可少的。它们的大斯托克斯位移扩展了可用于实验的荧光通道的种类。然而，供体荧光染料与受体分子的饱和度可能因批次而异。这会导致供体荧光染料的发射行为不同。因此，不同的抗体批次可能需要不同的补偿值。这意味着补偿样品和实验样品必须使用完全相同的抗体偶联物批次。

Tip 8：可以使用补偿微球代替细胞

补偿微珠是「人工细胞」，可以装载荧光染料 - 抗体偶联物。然后它们可用于调节补偿。补偿微球满足上述许多要求，因此是通用且出色的补偿样本。