SiRNA 实验十大秘诀

RNA 干扰（RNAi）是一种转录后基因沉默的机制。同时也是一项成熟的实验技术，它的出现彻底改变了研究人员研究哺乳动物基因表达的方式，并持续为如今的基因功能研究提供有价值的实验结果。RNAi 技术大大提高了在哺乳动物细胞和动物模型中进行基因功能缺失分析的便利性、速度和特异性，因此长期以来一直是深受研究人员信赖的一种选择。

小干扰 RNA（siRNA）是 RNAi 技术中最为常用的一种手段，其在基础研究中已经发挥了巨大的作用。回到最基础的实验中，尽管已经非常成熟，想要顺利开展 siRNA 实验并拿到可靠的实验结果却不是那么容易的，除了选择高质量的稳定的siRNA 产品之外，还有很多实验设计和操作方面的注意事项。今天我们为大家总结了成功开展 siRNA 实验的十大秘诀。

1.每个基因设计并测试两到四条 siRNA 序列

为了找到一个潜在的靶点，分析感兴趣基因的全长寻找氨基酸序列。记录氨基酸和3′ 19核苷酸作为潜在的 siRNA 靶点。潜在的靶点随后通过对 GenBank 数据库的 BLAST 分析进行评估，去掉任何与其他基因有显著同源性的靶序列。如果可能的话，应该针对含有更少二级结构的靶 mRNA 区域设计 siRNA。

2.选择 GC 含量低的 siRNA

研究人员发现 G/ C 含量 40–55％ 的 siRNA 活性比 G/ C 含量高于 55％ 的高。

3.纯化体外转录的 siRNA

确保所有用于转染的 siRNA 大小和纯度。为了实现最高级别的纯度，我们建议使用玻璃纤维过滤器结合和洗脱，或用凝胶纯化。所用的凝胶为 15- 20％ 的丙烯酰胺凝胶，以除去反应体系中多余的核苷酸、短低聚物、蛋白质和盐。注意：化学合成的 RNA 通常需要通过凝胶电泳进行纯化。

4.谨防RNA酶！

痕量的核糖核酸酶便可以破坏 siRNA 实验。因为 RNA 酶存在于整个实验室环境下，包括你的皮肤、任何裸手碰过的物品或者任何在空气中暴露过的物品，所以采取措施防止和消除 RNA 酶污染非常重要。赛默飞针对 RNA 酶的检测和去除提供了全套系列的产品。

5.保持健康的细胞培养和严格的操作方案，以获得良好的转染可重复性。

一般来说，健康细胞的转染效率高于生长状态不佳的细胞。常规的低传代次数的传代培养细胞，可最大限度降低连续细胞系从一个试验到下一个试验过程中的不稳定性。进行优化实验时，我们建议转染 50 代以内的细胞。50 代以后的细胞不建议采用，因为转染效率会随时间的推移而下降。

6.避免使用抗生素

从铺盘直到转染后 72 小时内，应避免使用抗生素。在转染的细胞中，已经显示出抗生素积累到了毒性水平。为获得最佳的siRNA输送效果，某些细胞和转染试剂需要无血清的条件。我们建议在正常的生长培养基和无血清培养基中均做转染试验，以确定每个转染实验的最佳条件。

7.使用优化的试剂转染 siRNA

请使用您的细胞类型适用的最佳 siRNA 转染试剂和试验方案。对于 siRNA 试验，转染试剂的选择对于试验成功与否至关重要。最关键的是，应使用专门配制、输送小分子 RNA 的转染试剂（大部分市售的转染试剂设计用于大型质粒 DNA，而不是小 RNA 分子）。此外，仅有部分试剂设计用于特定细胞系的转染，而多数试剂的特异性范围较广。Lipofectamine RNAiMAX 是专为将 siRNAs 高效转染真核细胞而设计的转染试剂。

8.使用一个适当的阳性对照来优化转染和检测条件

对于大部分细胞，管家基因适合作为阳性对照。向靶标细胞转染几个浓度的、对您所选择的阳性对照特异的 siRNA。（这也适用于您的试验靶标 siRNA。） 转染 48 小时后，测量对照蛋白或 mRNA 水平相对于未转染细胞的减少量。太多的 siRNA能导致细胞毒性和死亡。赛默飞提供适用于各种靶标基因的阳性对照 siRNA。

9.使用阴性对照 siRNA 来区分非特异性效应

通过打乱最活跃的 siRNA 碱基序列排列，可以设计一个适当的阴性对照。一定要做好同源性搜索，以确保它与正在研究的生物体基因组缺乏同源性。

10. 使用标记的 siRNA 来进行试验方案优化

荧光标记的 siRNA 可用于分析 siRNA 的稳定性和转染效率。标记的 siRNA 也可用于研究 siRNA 的亚细胞定位，并可在双标记实验中（使用标记的抗体），追踪转染过程中转入 siRNA 的细胞以及转染关联的靶标蛋白下调。

文章来源：赛默飞世尔科技