荧光定量 PCR 反应没有平台期—看完这篇文章，不必再纠结

许多用户在做荧光定量 PCR 实验中，总会向我们来电咨询：荧光定量 PCR 需要跑到平台期才准确？我的扩增曲线没有平台期，是不是使用的试剂不好？是不是扩增失败了？也有些用户会通过增加 PCR 循环数来实现平台期，这种做法是否可取呢？下面我们将以一组对比实验为例来看看平台期到底是否会影响定量结果，又有哪些因素会影响到扩增曲线的平台期呢？

来看一个典型的例子（图 1），这是一组 6 个梯度稀释的标准品，扩增曲线指数期之后是漫长的线性扩增期，直到循环结束也没有出现明显的平台期。这样的结果能否得到理想的标准曲线用于定量分析呢？

图 1. 标准品扩增曲线

我们回顾一下定量 PCR 的数学原理：

荧光定量 PCR 是在扩增曲线的指数期内划定阈值线，取阈值线与扩增曲线的交点所得到的 Ct 值（图 2）进行定量分析。这样做的原因也早已通过实验证明：以同一个样本进行 96 次相同的重复实验（图 3）可以看到 PCR 反应的终产物即平台期的荧光信号差异较大，重复性差，从而导致定量不准确，因此不适合用于定量分析。而指数期内荧光信号重复性好，所以用这个阶段的数据可以对靶标基因进行准确定量。另外，在指数期的开始，所有试剂仍有剩余，DNA 聚合酶仍然高效，扩增产物的量较少，不会竞争引物的退火性能。所有这些均可提高数据的准确度。

图 2. 阈值线和 Ct 值

图 3. 指数期和平台期重复性比较

我们知道反应效率对实时荧光定量 PCR 数据的准确度极为重要，理想状态下每经过一个循环，PCR 反应中的靶标基因就被复制一次，整个 PCR 产物量就翻倍，这对应了 100% 扩增效率。软件计算定量结果也是以 100% 扩增效率为前提进行分析的，扩增效率偏差越大，定量结果就越不准确。在实际实验中，可接受的分析验证范围为 90-110%。根据公式 E = 10(-1/slope) – 1 换算，该效率范围对应的标准曲线斜率为-3.6 至-3.1。

我们来看这个实验得到的标准曲线数据，扩增效率为 99.247%，斜率为-3.34，R2 为 0.999，各项参数几乎完美（图 4）。所以这个实验结果中虽然扩增曲线没有明显的平台期，但是不影响荧光定量 PCR 的定量分析。

图 4. 标准曲线

通过以上分析，相信大家已经了解到荧光定量 PCR 实验中扩增曲线的平台期不是必须的，判定实验结果好坏的指标应该是扩增效率是否在可接受范围内。如果扩增效率过低，则需要考虑优化反应体系，例如摸索最适合的引物探针浓度，退火温度，离子浓度等等，必要的情况下可以重新设计合适的引物探针；如果扩增效率过高，则可能是梯度稀释加样不准确或者反应体系中存在一些抑制物，如样品中的肝素，乙醇残留等。这种情况就需要进一步纯化模板或者重新提取样品。

讲到这里，也许对自己严格要求的你可能仍然有进一步优化扩增曲线的需求。下面我们来看一个优化反应体系之后的例子：

图 5 是使用上述案例中相同模板和试剂进行实验的结果，可以看到扩增曲线明显上升的更快，平台期也早早就出现了，整个曲线是不是看起来让人极度舒适？

图 5. 调整反应体系后的扩增曲线

这是因为对反应体系中的引物用量稍做调整。减少了引物用量，使 PCR 反应进行到后期由于引物被消耗完而无法继续复制，所以 PCR 产物无法增加，整个反应则进入了平台期。再来看扩增效率并没有得到提升（图 6），甚至有一点下降。说明之前的实验结果相比之下更为理想，引物浓度也更加合适， 一味追求平台期的出现而对反应体系进行调整是没有必要的。

图 6. 调整反应体系后的标准曲线

除了引物浓度，还有许多因素影响到 PCR 反应的平台期。例如定量试剂中酶的活性，dNTP 用量以及 PCR 产物的抑制等，这里我们就不展开讲解了。

参考文献：

Amplification efficiency: linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data. J. M. Ruijter, C. Ramakers et al.

《荧光定量 PCR 手册》. Applied Biosystems.

Real-time PCR: Understanding Ct. Applied Biosystems.