采用Ostro 96孔样品制备板轻松提高DBS萃取物的洁净程度

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应用优势

■ 使用更快的孔内分析 方式，更简洁的单步提取法进行DBS提取

■ 去除99.9%磷脂

■ 消除磷脂在LC色谱 柱中的蓄积，提升方法稳定性

沃特世解决方案

Xevo ^®  TQ-S MS系统

ACQUITY UPLC^® BEH C₁₈ 柱

Ostro™ 96孔样品制备板

引言

干血斑分析法(DBS)在医药行业正变得愈发重要。动物实验 所带来的经济及伦理道德方面的问题，以及在运输以及储存生物样品时所产生的高额费用问题，都使得DBS分析法成为一种颇具吸引力的选择。DBS分析法可取得较高的分析物回收率。然而，该技术在去除内源性干扰方面收效甚微。以残余磷脂(PLs)为主的干扰物是生物分析中遇到的主要问题。而LC/MS/MS系统中PLs的蓄积，则是引发基质效应的主要原因。在所有其他问题之中，基质效应会以无可预测的方式影响质谱响应值，降低分析方法稳定性并增加其可变性。Ostro 96孔样品制备板则可消除99%以上的PLs残留。Ostro 96孔板可通过使用96孔制备板的形式进一步简化DBS萃取流程，同时提取分析物、去除磷脂、过滤干血斑纸片。DBS样品可在孔内萃取并稀释直接进样到LC/MS/MS系统中。该创新方法能够显著降低样品制备时间，并在萃取转化、干燥、复溶过程中避免潜在的分析物流失。在本应用纪要中，我们同时应用了传统方法和Ostro 96孔样品制备板方法，对含有利培酮、利培酮羟基化代谢物、9-OH利培酮及其内标氯氮平(图1)的全血样品进行了萃取。

实验部分

ACQUITY UPLC条件

色谱柱： ACQUITY UPLC BEH C₁₈ ，2.1×50 mm，1.7 μm

流动相A： 0.1% NH₄ OH 水溶液

流动相B： 50/50 ACN/MeOH

流速： 0.6 mL/min

梯度：

时间         梯度模式        梯度线型

(min)       %A    %B

0.0            75     25                6

2.0           0.5     99.5             6

3.0           0.5     99.5             6

3.1            75      25               6

3.5            75      25               6

进样量： 40 μL

进样模式： 部分环进样

柱温： 35 ℃

样品温度： 15 ℃

强洗针液： 60:40 ACN:IPA+2% HCOOH

弱洗针液： 95/5 H₂ O/MeOH

沃特世Xevo TQ-S MS运行条件，ESI +

毛细管电压： 3.0 V

脱溶剂温度： 550 ℃

锥孔气流速： 150 L/Hr

脱溶剂气流速： 1000 L/Hr

碰撞池压力： 2.6×10^(-3)  mbar

MRM通道监测，ESI⁺ 参见表1

样品制备条件

将20 μL的全血样品滴在未经处理的Whatman DMPK-C血卡上。样品随后在室温下干燥2小时。使用Harris 3 mm微打孔器取3 mm血斑，分别放置进传统型DBS萃取法所需的1.5 mL离心管 和Ostro 96孔板孔中。传统萃取方法在1.5 mL离心管中进行，使用了250 μL含5%水的甲醇溶液，随后样品进行1分钟涡旋、1分钟3000 g离心，并最终将萃取物转移至96孔板上。使用Ostro 96孔板的萃取则采用单步孔内萃取法。在Ostro 96孔板中添加3 mm干血斑(图2)。以250 μL含5%水的甲醇溶液作为萃取溶液，涡旋操作1分钟、真空操作5分钟。两种方法产生的洗脱液都用250 μL 的水进行稀释，然后进样到LC/MS/MS系统中。

结果与讨论

在正离子模式下进行MS分析。鉴于DBS萃取物的直接进样通常会导致极稀释的样品，我们采用Xevo TQ-S以显著提升系统的灵敏度。这同时也有助于直接进样，并避免了吹干、复溶过程中可能存在的问题。

针对每一种样品制备方法，我们都比较了磷脂残留量。为了达成这一目的，我们对单个试管萃取和使用Ostro PLR板孔内萃取的DBS进行了比对，对五种磷脂进行了量化。与传统型DBS分析法相比，Ostro板去除磷脂比例高达99.9%(图3)。为能直观展示残余磷脂，传统型DBS萃取法和使用Ostro的孔内DBS萃取法所产生的五种不同磷脂的总离子流(TIC)如图所示(图4)。当使用Ostro板时，磷脂残留量几乎可忽略不计，且无蓄积情况。而当使用传统型DBS法时，即便出于预防磷脂蓄积的目的，采用高比例有机溶剂进行了1分钟的清洗，磷脂残余量依旧显著，而且在整个过程中都有蓄积。我们进行了半验证，计算QC样品浓度不足预期值的15%，满足法规标准。9-OH利培酮(图6)及其母化合物LLOQ在全血中都达到 0.05 ng/mL。标准曲线在3个以上数量级呈线性，全血中的线性范围从0.05 ng/mL到50 ng/mL(图7)。

结论

■ 简便、单步的DBS样品制备方法

■ 相较于传统的DBS萃取技术，去除残余磷脂含量高达99.9%

■ 采用Xevo TQ-S质谱 仪，获得高灵敏度

■ 去除LC色谱柱中PLs的蓄积

下载应用纪要请点击：http://www.waters.com/waters/library.htm?cid=511436&lid=13463293 5&locale=zh_CN

标签: 沃特世 DBS萃取物

作者：Jessalynn P.Wheaton, 点击： 次