96孔微量滴定板碱裂解法
最新修订时间：
原理
当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。这个方案可以在一天内快速制备数以百计的质粒。
材料与仪器
细菌克隆
TYGPN培养液 异丙醇
96孔微量滴定板 多道加样器 多管涡旋混合器 低速离心机
TYGPN培养液 异丙醇
96孔微量滴定板 多道加样器 多管涡旋混合器 低速离心机
步骤
1. 在96孔微量滴定板上每孔中加人0.3 ml TYGPN培养液，每孔中接种一个含有质粒的单菌落，于37°C培养至饱和状态（约48 h）。
2. 饱和培养液于4°C，以600 g用带有微孔板卡槽的H-1000 B转子离心10 min，轻轻甩去每孔中的上清液。
3. 将平板夹在多管涡旋混合器上置4挡振荡20 s，重悬细菌。
4. 每孔先加人50 μl GTE溶液，再加人100 μl NaOH/SDS溶液，放置2 min。
5. 每孔加人50 μl 乙酸钟溶液，盖上盖子或封口膜（Parafilm)。
6. 于涡旋混合器上置4挡剧烈振荡20 s，然后于4°C，600 g离心5 min。
7. 用枪头插人孔底的U字型的壁底，从每孔吸取200上清液至另一块新的平板中。
8. 在新板每孔中加入150 μl异丙醇，盖好盖子，振动混匀，于-20°C冷冻30 min。
9. 于4°C，600 g离心25 min，弃上清。用冰冷的70%乙醇洗涤沉淀，轻轻吸去上清，再用95%乙醇洗涤，同样轻轻吸去上清。
10. 空气中干燥30 min后用50 μl TE重溶沉淀。于4°C短期保存，于-20°C或-70°C 长期保存。并每孔取10 μl进行分析。
2. 饱和培养液于4°C，以600 g用带有微孔板卡槽的H-1000 B转子离心10 min，轻轻甩去每孔中的上清液。
3. 将平板夹在多管涡旋混合器上置4挡振荡20 s，重悬细菌。
4. 每孔先加人50 μl GTE溶液，再加人100 μl NaOH/SDS溶液，放置2 min。
5. 每孔加人50 μl 乙酸钟溶液，盖上盖子或封口膜（Parafilm)。
6. 于涡旋混合器上置4挡剧烈振荡20 s，然后于4°C，600 g离心5 min。
7. 用枪头插人孔底的U字型的壁底，从每孔吸取200上清液至另一块新的平板中。
8. 在新板每孔中加入150 μl异丙醇，盖好盖子，振动混匀，于-20°C冷冻30 min。
9. 于4°C，600 g离心25 min，弃上清。用冰冷的70%乙醇洗涤沉淀，轻轻吸去上清，再用95%乙醇洗涤，同样轻轻吸去上清。
10. 空气中干燥30 min后用50 μl TE重溶沉淀。于4°C短期保存，于-20°C或-70°C 长期保存。并每孔取10 μl进行分析。
来源：丁香实验
