煮沸小量制备法
最新修订时间：
原理
当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。推荐采用本方案从1-24个菌落培养液中制备少量的质粒DNA，尽管该方案十分快捷，但制备的DNA的质量要比碱裂解法差。
材料与仪器
细菌克隆
LB培养基 抗生素 STET溶液 卵清溶菌酶 水 异丙醇 TE缓冲液
LB培养基 抗生素 STET溶液 卵清溶菌酶 水 异丙醇 TE缓冲液
步骤
1. 接种一个单菌落于5 ml LB培养基中，于37°C培养至饱和状态或至少到对数生长中期（约6 h）。
2. 取1.5 ml菌液以最大转速离心20 s，弃上清。
3. 加入300 μl含200 μg溶菌酶的STET溶液重悬沉淀。在涡旋混合器上振荡混匀，冰上放置 30 s~10 min。
4. 将管放人沸水中（100°C）1-2 min。
5. 离心15-30 min，吸上清移入一个新的微量离心管中。
6. 加人200 μl预冷的异丙醇，于-20°C放置15-30 min。
7. 以最大转速离心 5min，倒转离心管，弹数次，去除上清，真空干燥直至沉淀呈透明。
8. 沉淀溶于50 μl TE缓冲液中，于4°C短期保存，于-20°C或-70°C长期保存。取5 μl进行限制酶酶切分析。
2. 取1.5 ml菌液以最大转速离心20 s，弃上清。
3. 加入300 μl含200 μg溶菌酶的STET溶液重悬沉淀。在涡旋混合器上振荡混匀，冰上放置 30 s~10 min。
4. 将管放人沸水中（100°C）1-2 min。
5. 离心15-30 min，吸上清移入一个新的微量离心管中。
6. 加人200 μl预冷的异丙醇，于-20°C放置15-30 min。
7. 以最大转速离心 5min，倒转离心管，弹数次，去除上清，真空干燥直至沉淀呈透明。
8. 沉淀溶于50 μl TE缓冲液中，于4°C短期保存，于-20°C或-70°C长期保存。取5 μl进行限制酶酶切分析。
注意事项
1. 为了获得高产量的DNA，一定要使菌体完全重悬。
2. 如有必要，往待消化混合液中加人10 mg/ml RNA酶溶液（不含DNA酶，见3. 10)以去除 污染的RNA。
2. 如有必要，往待消化混合液中加人10 mg/ml RNA酶溶液（不含DNA酶，见3. 10)以去除 污染的RNA。
常见问题
1. 参考文献：Birnboim，1983； Heetal., 1991; Holmes and Quigley, 1981.
2. 撰稿人：JoAnneEngebrecht, Roger Brent, and Mustak A, Kaderbhai
2. 撰稿人：JoAnneEngebrecht, Roger Brent, and Mustak A, Kaderbhai
来源：丁香实验
