煮沸法提取小量质粒

试验原理：

煮沸法是根据Holmex和Quigley(1985)的方法改进而成的。在基因工程中，DNA分子的切割是由限制性内切酶来完成的。限制性内切酶能识别特定的 DNA 序列，在一定的条件下切断双链DNA 。限制性内切酶的作用效率是受多方面因素影响的，如反应温度，缓冲体系，离子种类与浓度，DNA的纯度和甲基化程度等。对DNA进行酶切时，首先要选择适合的缓冲液。对于单酶切，应选用该酶的最适缓冲液；对于双酶切或三酶切，应选用一种能使所有酶都充分作用的缓冲液。DNA的纯度对于酶切的效果的影响也很大，因为蛋白质、酚、氯仿、SDS 等杂质都会抑制限制性内切酶的活性。

琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化DNA的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料 - 溴化乙锭进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。如有必要，还可以从凝胶中回收DNA 条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kbp的DNA。长度 100kb或更大的DNA，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。

在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。 DNA 分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。

实验准备：

1. 70% 乙醇（ -20 ℃）及无水乙醇（ -20 ℃）

2. STET 缓冲液（ pH8.0 ）（ 8% 蔗糖， 0.5%Triton，50mmol/L EDTA，10mmol/L Tris ）

3. 1.2M 氯化钠

4. TE 缓冲液（ 10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA ）

5. STET：0.1mol/L NaCl，10mmol/L TrisCl（pH8.0），1mmol/L EDTA（pH8.0），5％Triton X－10（其他同碱裂解法）

试验步骤：

1. 无菌操作台上取1.5ml培养菌体置于离心管（Eppendorf管）中，微量离心机上10000rpm离心1min，或者以4000rpm离心5－10min，弃上清液，倒扣于干净的吸水纸上吸干。

2. 将菌体沉淀悬浮于350µl STET缓冲溶液中，涡旋使其混匀。

3. 加入25µl新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml，用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制)，涡旋振荡大概3秒钟。

4. 将eppendorf管放入沸水浴中，40秒后立即取出。

5. 微量离心机上以4℃，12000rmp离心10min。

6. 用无菌牙签从eppendorf管中挑去细菌碎片。

7.在上清中加入40µl 5mol/L乙酸钠（pH5.2）和420µl异丙醇，振荡混匀，于室温放置5min。

8. 微量离心机上以4℃，12 000rmp离心5min，回收核酸沉淀。小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。（可参考裂解法中的做法）。

9. 加入1ml 70％乙醇，以4℃，12 000rmp离心2min。轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，室温下放置，直至乙醇挥发完全，管内无可见的液体为止（大概需要2－5min）。

10. 用50µl无DNA酶的胰RNA酶（20µg/ml）的TE(pH8.0)溶解核酸，稍加振荡即可，贮存于-20℃。

注意事项：

1. 大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。

2. 添加溶菌酶一定要有限度，浓度过高细菌裂解效果反而不好，有时不同溶菌酶也能溶菌。

3. 提取的质粒DNA中会含有RNA，但RNA并不干扰进一步实验，如限制性内切酶消化，亚克隆及连接反应等。

4. 试验步骤中的细菌沉淀和核酸沉淀中去除上清液时，一定要除尽。

5. 用70%的乙醇溶液洗涤核酸沉淀时一定要十分谨慎，防止将核酸同洗液一起倒掉。

6. 实验过程中所用的器皿和吸头都要进行高压灭菌。

7. 当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌株（endA+株，如HB101 ）中小量制粒DNA时，建议不用煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶A，在Mg2+存在下温育（V中用限制酶时）质粒DNA可被降解。 若要避免这一问题可以在用70％乙醇洗涤一步前增加一步用酚/氯仿进行抽提。

8. 如果要通过限酶切割反应来分析DNA，可取1µlDNA溶液加到另一个含8µl水的微量离心管内，加1µl 10x限制酶缓冲液和1单位所需限制酶，在适宜温度温育1－2h。将剩余的DNA贮存于－20℃。通过凝胶电泳分析经限制酸消化的DNA段。

如果小量制备的DNA不被限制酶切开，很有可能在收获细菌的步骤中未能很好地去除所有上清液体。这种情况下，可用酚：氯仿抽提DNA终产物，然后用乙醇重新沉淀DNA，通常，用5－10倍过量的酶（特别是并不昂贵的酶）在100-200µl 体积中进行消化，可以克服限制酶切割反应遇到切割反应遇到的困难。消化后， 加0.1体积3mol/L乙酸钠（pH5.2)和2倍体积乙醇沉淀DNA。