碱裂解法
最新修订时间：
原理
当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。碱裂解法是最常用的小量制备质粒DNA的方法。
材料与仪器
细菌克隆
LB培养基 抗生素 葡萄糖 Tris EDTA NaOH SDS 乙酸钾 乙醇 水
离心机 试管 离心管 制冰机
LB培养基 抗生素 葡萄糖 Tris EDTA NaOH SDS 乙酸钾 乙醇 水
离心机 试管 离心管 制冰机
步骤
1. 接种一个单菌落于5 ml无菌LB培养液中，在37°C培养至饱和状态（过夜）。
2. 取1.5 ml培养液以最大转速离心20 s。弃上清。
3. 沉淀用100 μl GTE溶液彻底重悬并于室温静置5 min。
4. 加人200 μl NaOH/SDS溶液，用指头敲击管壁混匀，于冰上放置5 min。
5. 加人150 μl乙酸钾溶液，在涡旋混合器上振荡2 s混匀，于冰上放置5 min。
6. 离心3 min，然后吸取上清液移人干净的微量离心管中，加0. 8 ml 95%乙醇，于室 温静置2 min。
7. 室温离心1min ，弃上清，用1 ml 70%的乙醇清洗沉淀，然后真空干燥。
8. 沉淀用30 μl TE缓冲液重溶，于4°C短期保存，于-20°C或-70°C长期保存，取 2. 5-5 μl进行酶切分析。
2. 取1.5 ml培养液以最大转速离心20 s。弃上清。
3. 沉淀用100 μl GTE溶液彻底重悬并于室温静置5 min。
4. 加人200 μl NaOH/SDS溶液，用指头敲击管壁混匀，于冰上放置5 min。
5. 加人150 μl乙酸钾溶液，在涡旋混合器上振荡2 s混匀，于冰上放置5 min。
6. 离心3 min，然后吸取上清液移人干净的微量离心管中，加0. 8 ml 95%乙醇，于室 温静置2 min。
7. 室温离心1min ，弃上清，用1 ml 70%的乙醇清洗沉淀，然后真空干燥。
8. 沉淀用30 μl TE缓冲液重溶，于4°C短期保存，于-20°C或-70°C长期保存，取 2. 5-5 μl进行酶切分析。
注意事项
1. 如有必要，在酶切反应液中加人1 μl 10 mg/ml RNA酶溶液（不含DNA酶）以去除污染的RNA。
来源：丁香实验
