病毒衣壳装配和核酸包装机制的研究进展
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<font> 病毒是目前所知最简单的生命单位，只有核酸和<u>蛋白</u> 质组成。病毒衣壳装配和核酸包装机制的研究对病毒复制、病毒病防治和阐明生命活动的基本规律具有重要意义。分子病毒学的研究成果促进了病毒衣壳装配和核酸包装机制的研究，近几年有关病毒装配和核酸的包装机制研究取得了较大的进展。本文就病毒衣壳的装配途径、装配原理、核酸包装机制和包装信号序列等综述如下。</font>
1 病毒衣壳装配途径
病毒颗粒主要由核酸和蛋白 质组成，核心为病毒基因组，为病毒增殖和遗传变异提供遗传信息。衣壳可保护病毒核酸免受外界因素影响破坏，并可介导病毒核酸进入细胞内部，衣壳是病毒的主要抗原成份，是研制病毒蛋白 疫苗的主要靶位。病毒衣壳是由病毒结构蛋白 装配形成的，病毒主要衣壳蛋白 具有自身装配成病毒样颗粒的特性(virus-like particle, VLP)，即无有核酸的病毒空衣壳。有些病毒可能还需病毒编码的骨架蛋白 (scaffolding protein)辅助，这些病毒衣壳被称为原头(prohead)、原壳(procapsid)或病毒样颗粒(Virus-like particle, VLP)［1］。噬菌体衣壳装配首先由12个孔道蛋白 gpI聚合成玫瑰形的十二聚体顶角，此顶角为病毒核酸包装和感染细菌过程中核酸出入的通道［2］。在疱疹病毒感染的细胞内有三种衣壳：A型衣壳为一空壳，不含病毒核酸及内部结构；B型衣壳又称中间型衣壳，不含病毒核酸，但在病毒外壳内还有一蛋白 质层；C型颗粒为完整的病毒颗粒。B型衣壳是A、C型的前体，B型衣壳的蛋白 质层为骨架蛋白 ，由VP21、VP22a组成，在A型和C型中消失。病毒衣壳中主要衣壳蛋白 VP5约占70%，其余衣壳蛋白 VP19c、VP23、VP26约占30%，仅有这4种衣壳蛋白 还不能形成病毒衣壳，只能形成异型多聚体。只有在骨架蛋白 辅助下方可形成HSV B型衣壳。HSV病毒衣壳装配可分为以下几步：(1)病毒主要衣壳蛋白 (VP5)与蛋白 酶(VP24)前-VP21及前-VP22a共价形成小分子复合物，在附件蛋白 (VP19c、VP23)辅助下逐渐形成部分衣壳和完整的B型衣壳。VP5形成HSV-1的衣壳主要部分，前-VP21和前VP22a为骨架蛋白 ，形成衣壳内部蛋白 质层。蛋白 酶VP24在两层之间发挥桥梁作用。(2)VP24水解前-VP21和前-VP22a，改变了骨架蛋白 的形态与结构，VP24与前-VP21分离而与VP5共价结合附着在衣壳上面，VP21与VP22a形成缩小的骨架蛋白 层。(3)HSV DNA通过末知机制进入B型衣壳伴随VP21、VP22a出壳，衣壳蛋白 构象变化、结构亚基重排形成为成熟C型颗粒。如果病毒DNA包装失败，骨架蛋白 出壳或降解，而VP24与VP5共价连接形成A型衣壳。HSV衣壳经GuHcl处理后，病毒DNA以细条带形式从衣壳顶角处出壳［3］。因此认为HSV衣壳五邻体顶角为病毒DNA出入衣壳的位置，GuCl处理导致五邻体短暂开放，DNA出壳后再恢复原始状态［4］。
2 病毒衣壳装配的几何原理
60年代初，Kaspar和Klug等提出用准等构理论(theory of quasiequivalence)解释大量病毒蛋白 亚基组成球状病毒20面体立体对称结构的机理。根据这一理论，所有结构蛋白 亚基在组成球状壳体的排列，并不严格按照球状所要求的严格等构方式，而是由亚基之间连接发生一些畸变，从而导致了轻微的不对称，这样大量结构蛋白 亚基只有根据20面体立体对称，形成一个等距球体。衣壳应有20个面，12个顶角，30条边，且有5、3、2三种对称轴，蛋白 亚基具有相同的构象，衣壳由五邻体和六邻体构成，只能有12个五邻体，六邻体的数目为10的倍数［6］。然而还有一些病毒为非准等构理论结构，如乳多空病毒衣壳由72个壳粒组成，全部为五邻体，其中有12个五价五邻体和60个六价五邻体。电镜研究表明病毒结构蛋白 可存在几种不同的构象，如P22噬菌体衣壳蛋白 gp5有7种构象、SV40的VP1共有六种构象。因而Berger等于1993年提出局部法则理论［7］(local rule-based theory)认为病毒结构蛋白 亚基可具有几种不同构象，蛋白 亚基构象间的特异识别及聚合形成病毒衣壳装配的动力，进而形成一个闭合的衣壳。若在蛋白 亚基装配过程中有一次构象识别错误，则导致衣壳形成不能闭合的螺旋状结构。病毒的空心衣壳与成熟的病毒颗粒衣壳结构还有一些显著差别。病毒空心衣壳结构疏松，沿衣壳的5、3、2对称轴上有贯穿衣壳的裂孔。当病毒DNA包装完成以后，病毒衣壳变得致密，裂孔关闭，至少在衣壳内2/3处关闭。伴随病毒核酸包装，病毒衣壳膨胀，衣壳蛋白 构象可发生变化［8］。如噬菌体HK97为20面体立体对称结构，衣壳由415主要结构蛋白 构成，衣壳蛋白 亚基分子量为42KDa，无骨架蛋白 ，在病毒衣壳装配过程中可出现4种衣壳演变形成：①proheadⅠ：由415个42KDa的结构蛋白 亚基构成，衣壳蛋白 之间无酶解、共价交联和构象变化，易被离解为多个壳粒。②proheadⅡ：衣壳大小不变，由于衣壳蛋白 氨基端被水解而变为31KDa，所以衣壳内层密度变弱。③HeadⅠ：病毒核包装，衣壳膨胀，厚度变小，成为多角体，壳粒结构发生明显变化，各结构蛋白 亚基之间发生交联。④HeadⅡ：酶解后的31KDa衣壳蛋白 亚基之间以共价键交联，形成5、6个或多个蛋白 亚基形成的寡聚体，衣壳蛋白 构象发生变化，各亚基之间重排形成牢固的20面体立体对称结构。
3 病毒核酸包装机制
病毒核酸包装可能有两种包装机制，一种以乳多空病毒为代表，病毒基组与细胞组蛋白 首先形成微型染色体，然后病毒结构蛋白 以病毒微型染色体为支架，不同构象的蛋白 亚基之间特异识别与聚体逐渐装配形成封闭的病毒颗粒，核酸包埋其中，似“作茧自缚”。但在无病毒DNA时，衣壳蛋白 仍可装配病毒样颗粒(VLP)，表明病毒衣壳装配是不必依赖于其DNA为支架的［9］。另一种以噬菌体、腺病毒、疱疹病毒为代表，其机制为病毒结构蛋白 在细胞内预先形成衣壳，然后病毒DNA被特异识别并包装进入衣壳，形成完整的病毒颗粒。这类病毒DNA复制时，病毒基因组可从多个复制起始点开始，一个复制周期完成之前，下一个复制周期已开始形成基因组首尾相接的串联体(Concatamer)，病毒以串联体为底物，由病毒编码的包装酶(package enzyme)或未端酶(Terminase)将病毒基因组从串联体上包装起始点特异切割(首次切割)，当一个单位的病毒基因组从孔道蛋白 或五邻体进入并充满衣壳后，由Head机制启动末端切割，从而完成病毒DNA包装。而某些病毒DNA复制结束后，就形成一个完整的基因组，如腺病毒DNA5′端共价连接DNA结合蛋白 TBP，在包装过程中不需对DNA切割［10］。
病毒包装酶是由病毒基因编码，分为大小两个亚基，大亚基可特异结合病毒衣壳顶角处的孔道蛋白 、金属离子及ATP。小亚基可特异识别与结合病毒核酸及ATP。包装酶都具有保守的ATP结合框架，因而具有ATP酶活性。在DNA包装过程中，每包装两个碱基对则需消耗一个ATP。依据包装酶对DNA切割的特异性不同又可分为三种类型：第一类为特异的首末次切割，因而病毒衣壳中核酸具有相同的长度，如SV40、T3、T7噬菌体。第二类为在病毒DNA特定区域发生非序列特异性切割，如T1、P2、P22、SPP噬菌体，病毒衣壳中核酸长度有轻微差异。第三类为完全非特异性切割，如T-even, 因而衣壳中的核酸是随机的［11］。最近研究发现噬菌体Φ29包装机制与其它噬菌体又有不同：在其DNA包装过程中还需一病毒DNA5′端编码的一小段RNA被称为包装RNA(pRNA)。pRNA5′和3′端在DNA包装过程中发挥关键作用［12］。pRNA一端可结合于P22孔道蛋白 上，另一端则以短暂互补方式结合于病毒基因组5′端。病毒核酸进入衣壳的方式有以下几种学说：包装酶与孔道蛋白 形成渗透压泵模型、可转动螺纹模型、捕捉臂模型、搬手模型等。病毒DNA进入衣壳后其体积将是包装前的1/30～1%。
4 病毒基因组包装的信号序列
病毒核酸包装是一个复杂的过程，是蛋白 质与蛋白 质及蛋白 质与核酸之间的复杂作用引起的。病毒结构蛋白 或病毒包装酶识别病毒核酸，并从细胞大量DNA中特异选择包装病毒DNA，其机制目前尚不十分清楚。但大量研究表明在病毒基因组上游调节区或编码包装酶的基因中有一核酸包装信号序列，称为包装序列(Pac序列)。某些病毒pac序列包括包装酶特异识别与切割两个部分。包装序列可与包装酶或衣壳结构蛋白 发生特异识别。目前研究较为深入的有噬菌体、腺病毒、疱疹病毒、SV40等。噬菌体pac包装序列包括三部分，cosN、cosQ、cosB。包装酶gpA、gpNUI可在串联体上cosN位点处特异切割形成粘末端，cosN为包装酶特异切割位点，cosB为包装酶特异识别结合点位，cosQ为基因组包装完成以后末端切割位点。只有包装酶在N1和N2两点切割形成12个碱基末端方可被特异包装。其它切割形式因不稳定而降解［13］。腺病毒包装信号序列位于反向重复序列ITR与EIA之间的230～380核苷酸内，有一系列AT重复序列组成，至少需3个AT重复序列参与DNA包装。SV40的包装信号序列为位于SV40 DNA复制起始位点ori附近的六个GC盒组成的ses结构。GC盒数目、位置及与ori距离都可影响SV40包装效率。SV40衣壳还可选择性包装SV40 ses结构携带的外源基因，并将外源基因导入SV40敏感的靶细胞核内［14］。HBV病毒复制具有逆转录病毒特性，HBV转录的前基因组Pg RNA被HBV衣壳蛋白 选择包装主要是由Pg RNA近5′端一段顺式元件介导的，称为E元件。E元件决定Pg RNA被特异选择包装。HBV衣壳蛋白 可特异包装E元件所携带的一大段外源基因。由于pac元件由大量重复序列组成且包含很多顺式反应元件，那么pac元件所形成的二级结构及其相应的反式作用因子对病毒核酸包装的影响目前尚不清楚。病毒装配机制的研究对病毒性疾病的防治具有重要意义。由于病毒衣壳可特异包装pac元件所携带外源基因，人们可借助病毒的组织亲嗜性，用衣壳蛋白 将目的基因特异包装并运送到特异靶细胞，可为人类基因治疗提供理想的载体。由于病毒结构蛋白 亚基上有病毒装配的非关键区域，可将外源表位上插入此处，而不影响病毒颗粒装配，人们可借助此开发携带多种外源基因的嵌合病毒样颗粒疫苗。
本文受国家自然科学基金资助(编号：3970038)
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