核酸酶的研究进展

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“基因组 编辑核酸酶”当选《自然》年度研究方法

《自然》杂志子刊《自然—方法学》在最新一期推出了2011年度研究方法专刊，评选出了本年度研究方法——基因组 编辑核酸酶(Gene-editing nucleases)。专刊包括社论、新闻特写、评论、视频等内容;同时，还评出其他8个值得关注的研究方法。

基因组编辑核酸酶是一类通过基因工程 改造的核酸酶，主要包括三大类：锌指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFNs)，转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases ，TALENs)和归巢核酸内切酶(engineered meganucleases)。基因组编辑核酸酶能够定位和准确改变生物基因组，这为研究基因功能、治疗疾病创造了新的可能性。

虽然在十年前才发现了第一个ZFN，但是该领域的工作在过去一年取得了长足的进步。2011年，临床上基因组 编辑技术取得重大突破，TALENs相关研究也获得了新成果。

日期：2012年1月2日

两种新技术鉴定锌指核酸酶切割脱靶位点的频率

锌指核酸酶(zincfinger nucleases, ZFNs)被设计为类似于热跟踪导弹，精确地导向以便找到并切割特异性DNA序列。然而，它们偶尔可能会剪错位点，导致未曾预料到的裂口。2011年8月7日发表在Nature 杂志子刊上的两篇论文描述了两种系统性地找到这种脱靶作用(off-target action)的方法，从而能够有朝一日有助于设计出避免间接伤害的基因治疗。

美国斯克利普斯研究所拉由拉市分所(The ScrippsResearch Institute in La Jolla)化学生物学者Carlos Barbas(未参与该项研究)说，“直到现在还没有一种真正综合性的方法来定义ZFN的特异性”，“当我们开始利用ZFNs治疗病人和修饰基因组时，我们需要知道这些修饰是在哪些序列位点进行的”。

锌指(zinc fingers, ZFs)，是因为它们的结构像只一个指头伸出的手而得名，结合到不同的三字母核苷酸序列。通过将几个锌指出串联在一起，再加入一个切割DNA的核酸酶，研究人员们能够精确地导向将被切割的特异性基因。这种特异性就为开发ZFN基因治疗提供可能。确实，一家制药公司Sangamo Biosciences正在人类安全性试验中测试一种治疗HIV的候选药物，其中该试验利用一种ZFN修饰HIV用来侵入细胞的T细胞受体CCR-5。

但是它不是一个完美的系统：有时这种分子可能结合并剪断一种不同但又几乎相同的DNA序列，从而潜在性地杀死细胞。

为了系统性地描述这些脱靶切割位点，哈佛大学化学生物学者David Liu和他的同事们利用1000亿个DNA片段组成的文库---一些片段在人类基因组中出现---对两种ZFN进行测试。大多数情况下，这些核酸酶切割靶位点，但是它们偶尔也切割其他类似序列---包括一种与癌症信号传导途径相关联的基因。

Liu说，“对我们论文的肤浅理解可能导致一个人对ZFNs持悲观态度，但是实际上我是乐观的”。他说，除了证实脱靶裂口所占份额会随着较低浓度的ZFNs下降外，研究人员们还发现使用与靶序列结合较差的ZFNs似乎产生更少的意料之外的裂口。这就表明有可能设计出使得这些脱靶效应最小化的ZFN治疗。研究人员们将他们的研究成果发表在Nature Methods杂志上。

在第二篇发表在 Nature Biotechnology杂志上的研究论文中，研究人员们给人白血病细胞施加一种切割CCR-5受体的ZFN。他们首先构建结合到DNA裂口末端的带有标记的病毒颗粒，然后利用这些病毒颗粒转染细胞，来鉴定ZFN切割位点，结果他们发现ZFN总体上结合到靶CCR-5 DNA序列。但是，它大约2万分之一的概率切割序列几乎相同的另一个受体基因，以及甚至更低概率地切割少数几个其他的类似序列。但是Sangamo BioSciences公司科技总监Phillip Gregory以及这篇研究论文的共同作者Phillip Gregory说，这些结果都是在研究人员们采用一种极度高浓度的ZFN和极易允许ZFN作用的细胞系的条件下进行的，目的是观察最糟糕的情形会是什么样子。他说，即便是在这些条件下，低概率的脱靶切割事件“证明我们的期望：ZFNs蛋白定会是高度特异性的”，而且暗示在临床中采用更低药用剂量将几乎不可能发生脱靶切割。

Barbas说，这些方法可能有朝一日用于早期药物开发以便筛选特异性最好的候选药物。他说，人们不清楚这些新ZFN测试的覆盖面是否刚刚好。比如，采用带有标记的病毒颗粒的方法可能会遗失一些脱靶切割，因为病毒标记可能并不结合到每个单裂口。再者，Barbas补充道，不同于试管中的DNA，细胞DNA紧密缠绕成染色质，因而在试管方法中发现的很多结合位点可能在活细胞得到保护并且从不会被ZFNs切割。

他说，尽管这些新的测试方法可能成为早期药物开发的关键性工具，但是一幅完整的ZFN脱靶位点图仅当花费1000美元获得一个人的全部基因组序列的情况下才会出现，届时研究人员们能够对接受ZFN治疗的人们进行测试以便找到每个脱靶裂口。

日期：2011年8月17日

锌指核酸酶技术可生成不可预知的错误

人们一直很期待定向的基因组改造工具。然而传统的基因组靶向修饰方法，如同源重组和逆转录病毒法，不仅效率低，特异性也不高。

锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFN)技术是近年来科学家们开发的一种基因组靶向修饰新技术。ZFN是人工改造的限制酶，由锌指结构的DNA结合结构域和DNA切割结构域融合而成。它们能够识别并结合指定的位点，高效且精确地切断靶DNA。随后细胞利用天然的DNA修复过程——“同源定向修复”或“非同源末端连接”来治愈靶的断裂。这样，研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑，包括基因修复、基因删除和定向的基因添加。

作为一种可能在临床中得到广泛应用的朝阳技术，锌指核酸酶得到了多方关注，并已经在几种不同系统内成功靶定了基因组，为生物学研究提供了新型工具。近期有报道称桑加莫生物技术公司利用ZNF技术生成的CCR5修饰自体T细胞产品SB-728-T，作为首个进入临床的基因修饰药物，在治疗HIV/AIDS的I期临床研究中获得了令人满意的结果。不断传来的进展消息让科学家们感觉将ZFN技术广泛应用到遗传学研究及基因治疗中的似乎已是指日可待了。

然而近日发布在国际著名科研期刊Nature官网上的一篇新闻报道有可能促使科学家们在真正将ZNF技术运用到临床中去之前更慎重地开展更多的相关检测研究。根据这则新闻的报道， 在8月7日同时发表在Nature出版社旗下子刊《Nature Biotechnology》和《Nature Methods》的两篇研究论文中，研究人员指出这一技术在进行基因修饰过程中存在着脱靶现象(off-target)。

日期：2011年8月16日

台湾外切核酸酶基因型和吸烟习惯的相互关系

SOURCE:Oral Oncology 近期发表在《Oral Oncology》上的一篇关于外切核酸酶基因型与吸烟习惯和口腔癌的关系。由于外切核酸酶(Exo1)是非常重要的核酸酶，参与DNA修复，调控细胞周期等，来自台湾的研究人员日前分析了Exo1单核苷酸多态性与口腔癌的风险性。在这个以医院为基础的研究中，Exo1的位点1419G(rs375409 )和C-908G(rs10802996)，A238G(rs1776177)，C498T(rs1635517)，K589E(rs1047840)，G670E(rs1776148)，C723R(rs1635498)，L757P(rs9350)和C3114T(rs851797)多态性与口腔癌的危险在中部地区的人口中进行了调查。来自中国医学大学医院的基因的680例口腔癌和680年龄和性别匹配的健康对照北进行基因分型。结果发现，Exo1 K589E基因分布在口腔癌和正常人之间有着显著的不同，A等位基因Exo1 K589E可以增加罹患口腔癌的风险(P=6.18×10-8 )。基因与吸烟环境的相互作用在Exo1 K589E多态性上游相关性(比率比为2.509，95%的可信限为1.914-3.287 )。该研究结果提供的证据表明 A等位基因的Exo1 K589E可能与口腔癌的发展有关。

日期：2009年6月26日

显花植物自交不亲和性机制研究

自交不亲和性(Self-Incompatibility, SI)是广泛存在于显花植物中的一种种内生殖障碍，对于物种避免近亲交配和保持遗传多样性具有重要意义。日前，中国科学院遗传与发育研究所薛勇彪研究员实验室，结合他们的最新研究结果，对包括泛素蛋白降解(ubiquitin-proteasome pathway)和液泡分拣途径(vacuolar sorting pathway)等快速和有效的蛋白水解途径，对植物自交不亲和性信号应答途径中的作用作了详尽的综述并提出了新的模式假说，该重要综述论文2008年10月份在线发表于植物学权威综述性杂志《植物生物学年评》(Annual Reviews of Plant Biology)(doi:10.1146/annurev.arplant.043008.092108)。

在以茄科植物为代表的配子体自交不亲和植物中，发现植物的自交不亲和性位点-S-位点(S-locus)编码两类不同的基因分别控制花柱和花粉自交不亲和性的表达。早期研究发现雌蕊分泌的S-核酸酶作为细胞毒素降解自花花粉管的RNA从而抑制花粉管生长，但是这种特异性降解的分子机制并不清楚。薛勇彪研究员，首先在金鱼草中克隆了一个新的自交不亲和性位点-S-位点编码基因，该基因是SLF(S-locus F-box) 家族的第一个成员-AhSLF-S2 (Lai et al., 2002, Plant Mol. Biol.)，并证明它控制了花粉自交不亲和性的表达(Qiao et al.,1996. Plant Cell)。F-box基因被广泛地证明为泛素蛋白降解系统中，泛素蛋白连接酶复合体SCF E3结合特异性底物的受体。最近，薛勇彪研究员实验室利用AhSLF-S2为诱饵，通过酵母双杂交，在花粉cDNA库中钓获一个SCF复合体中Skp1-like蛋白-AhSSK1。他们发现AhSLF-S2定位于并且它编码的蛋白质通过形成一个SCF(Skp1/Cullin or CDC53/F-box)复合体与S-核酸酶发生作用，并进一步证明泛素/26S蛋白小体介到的蛋白质降解途径特异性的参与了金鱼草的亲和反应(Huang et al., 2006, Plant J.)。他们提出了花粉S-位点编码基因的产物SLF可能参与SCF复合体和靶向S-核酸酶并将其降解的自交不亲和反应模型。

目前关于S-核酸酶的自交不亲和性有不同的假说模型，但是关键问题还是在于对S-核酸酶的约束(restriction)上。诸如：S-核酸酶被空间区域化还是被泛素化降解?或者两者共存?如果是平行进行，那么，自花的S-核酸酶和异花的S-核酸酶参与的细胞通路又有什么本质的差别?还是它们进入花粉管后，后期的亚细胞的分拣上不同?抑或，S-核酸酶泛素化作用对亚细胞的分拣有一定的作用?薛勇彪研究员实验室利用免疫电镜研究AhSLF-S2在自交不亲和型金鱼草花粉和花粉管的亚细胞定位，发现AhSLF-S2定位于内膜系统(endomembrane)(Wang & Xue 2005, J. Integra. Plant Biol.)。因此他们进一步提出了一个S-核酸酶分拣模型(S-RNase sorting model)来解释该花粉特征的特异性：S-核酸酶通过细胞内吞作用进入自花或异花的花粉管，S-核酸酶在相容的花粉管中，在早期的内涵体中被SCFCLF泛素化降解并被征募到类空泡结构;而在自花花粉管中，S-核酸酶被一未知机制释放到细胞质中，产生细胞毒素效应从而抑制自花花粉管的生长(Zhang et al., 2008, Annual Reviews of Plant Biology)。这一模型的提出为深入研究显花植物的自交不亲和反应的分子和细胞生物学机制提供了重要基础，也将为研究蛋白降解途径参与细胞信号转导提供新的范例。

日期：2008年11月12日

利用核酸酶治疗艾滋病

未来医生在处理艾滋病患的治疗方法时，很有可能在病毒尚未坐大时，就利用患者本身的免疫系统加以摧毁。

史丹佛大学感染医学教授Thomas Merigan博士，利用分析艾滋病毒遗传信息RNA所获得的数据，设计出能分解病毒，而专一性十分高的核酸酶蛋白(ribozyme)。而研究团队的抗爱滋策略，是把生产这种核酸酶蛋白的序列，送到血球干细胞之中，让患者自身的血球免疫系统在发育的过程中，就会产生这足以分解HIV病毒的酶蛋白蛋白。

目前经过初步的研究证明，这种基因疗法的安全性，因此研究小组获得相关单位同意，进行人体临床的研究。该计划正募集接受过一至二次抗病毒疗程的艾滋病患者，对象锁定18至45岁范围内，体内呈现相当低浓度的病毒量，而免疫T细胞情况稳定的确定病例自愿者。

日期：2006年12月21日