植物材料基因组多态性分析

一、 RAPD 技术的原理

 

RAPD 技术是由美国的 Williams 等人于 1990 年发明的。它是以聚合酶链反应技术 (PCR 技术 ) 为基础，利用人工合成的寡核苷酸为引物，以从组织中分离出来的基因组 DNA 为模板，通过基因放大器合成多态性 DNA 片段的一种方法。由于不同品种 DNA 序列存在着差异，其引物结合位点以及两结合位点之间的距离都有差异，这样经 PCR 扩增后就产生了 DNA 片段的多态性，从而形成了 RAPD 标记。 RAPD 标记具有以下特点：

⑴、标记数量多，因为 RAPD 分析所用引物的数量是无限的，所以它可以覆盖基因组中所有的位点。

⑵、标记所需模板 DNA 量小，因此不受季节、组织、器官及发育时期的限制。

⑶、所用引物没有物种限制，一套引物可以用于不同生物基因组分析。

⑷、分析方便、快速、无需克隆自卑、同位素标记、 Southern 转移等复杂的操作。

⑸、标记是显性的，因此不能区别生物个体是纯合型还是杂合型。

目前， RAPD 技术已广泛用于基因定位，寻找特定基因的连锁标记，物种识别，系统进

化，遗传多样性检测，遗传作图和遗传育种等众多领域。

由于 RAPD 技术是以 PCR 技术为基础的，因此为了更好的掌握 RAPD 技术，有必要先了解 PCR 技术。

1、 PCR 技术的原理

多聚酶链式反应技术简称 PCR 技术，是近年发展起来的一种体外扩增特异 DNA 片段

的技术，此法操作简单，可在短时间内获得数百万个特异序列的拷贝，因此 PCR 技术虽然问世时间仅数年，但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域。在分子克隆、遗传病的基因诊断、法医学、考古学等方面得到了广泛的应用。

PCR 技术与细胞内发生的复制过程十分类似，为在模板 DNA 、引物（ 16bp 以上，最好为 20~24bp ）和 4 种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于 DNA 聚合酶的酶促合成反应。按照反应的特点可将其分为三步：①、变性：通过加热使 DNA 双螺旋的氢键断裂，双连解开形成单链；②、退火：当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物 DNA 量大大多于模板，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板 DNA 双链之间互补的机会较少；③、延伸：在 DNA 聚合酶和 4 种脱氧核苷三磷酸底物及 Mg² 存在的条件下，由 DNA 聚合酶 5’ → 3’ 的聚合酶活性催化以引物为起点的 DNA 链延伸反应。以上 3 步为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性 DNA 片段将得到大量的复制，数量可达到 2 × 10^6~7 拷贝。

2、 RAPD 的原理

RAPD 技术通常是利用一系列（通常数百个）不同碱基顺序随机排列的寡聚核苷酸单链

（通常为 10bp ）为引物，对所研究基因组 DNA 进行 PCR 扩增。 RAPD 所用的一系列引物 DNA 序列各不相同，但对于任一一对特定的引物（可相同也可不同），如它们同基因组 DNA 序列有其特定的结合位点，这些特定的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合 PCR 扩增反应的条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物 3’ 端相距在一定的长度范围之内（ 200~2000bp ），就可扩增出 DNA 片断。因此如果基因组在这些区域发生 DNA 片断插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化，而使 PCR 产物增加、缺失或发生分子量的改变。通过对扩增产物的检测即可测出基因组 DNA 在这些区域的多态性，由于进行 RAPD 分析时可用引物数很大，虽然对每一对引物而言其检测基因组 DNA 多态性的区域是有限的，但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组，因此 RAPD 可以对整个基因组 DNA 进行多态性检测。两个物种的个体之间，亲缘关系越接近，其相应的 PCR 扩增带型也就越相似，反之则差异也就越悬殊。

二、多态性 DNA 随机放大的条件

 

大多在 Williams 等（ 1990 ）的基础上变动。一般每一个样品的最后混合液为 25ul ，其中

含 25ul 10 ×的 DNA 聚合酶缓冲液（由 Tris-HCl ， KCl ， MgCl₂ 和明胶等配成），各占 100umol/L 的 dATP 、 dGTP 、 dCTP 和 dTTP ， 0 ． 2umol/L 的引物， 20~25ng 的模板 DNA 和 0 ． 5 单位酶量的 DNA 聚合酶，然后用蒸馏水将混合物加到 25ul 。

三、影响 RAPD 的因素

 

1 、引物

引物的合成是随机的，但要满足以下两个条件： G C 的含量不低于 40% ， 5’ 与 3’ 端的碱

基顺序非反方向对称，否则就无法合成专一的少数几条 DNA 片段。引物的长度以 10bp 为佳，引物太短（＜ 9bp ）易从模板上脱落，聚合反应难以进行，引物太长，成本提高，合成多态性 DNA 片段的可能性降低。

引物的浓度通常是 0 ． 2umol/L ，这一浓度足以完成 40 个循环的扩增反应，引物浓度过高可能导致错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的几率，这两者均可竞争酶、 Dntp 和引物。但如引物浓度不足，则 PCR 的效率极低，扩增产物的产量太低。

2 、 Taq DNA 聚合酶：

酶在 70 ℃ ~75 ℃ 时具有最高的活力，此温度下每一个酶蛋白分子每秒可延伸约 150 个核苷酸，温度升高（＞ 80 ℃ ）或降低（＜ 70 ℃ ）时，聚合酶延伸速度明显下降。该酶具有良好的热稳定性， 95 ℃ 保温 2 小时，活性未见明显损失。

该酶具 5’ → 3’ 聚合酶活性和 5’ → 3’ 外切酶活力，但无 3’ → 5’ 的外切酶活力，因此，如 PCR 反应中发生某些核苷酸的错配，该酶没有校正功能。

该酶为 Mg² 依赖性酶， MgCl₂ 浓度在 2 ． 0mmol/L 时酶活力最高， Mg² 浓度偏高，酶活力受抑制。由于 Mg² 能与负离子或负离子团（如磷酸根等）结合，在 PCR 反应中模板 DNA 、引物及 dNTP 均可与 Mg² 结合，尤以 dNTP 的影响最大，所以 MgCl₂ 浓度在不同反应体系中应适当进行调整，一般反应中 Mg² 浓度至少应比 dNTP 总浓度高出 0 ． 5~1 ． 0mmol/L 。

KCl 的最适浓度是 50mmol/L ，高于 75mmol/L 时 PCR 反应明显抑制，均衡的 dNTP 有利于酶活性的发挥，并能减少错配和获得多量的特异性 DNA 扩增产物。

在 25ul 反应体系中，聚合酶的用量为 1~2U ，根据扩增片断的长度及复杂程度（ G C 含量）不同而有所区别，使用聚合酶浓度过高，可引起非特异产物的扩增，浓度过低，则合成的产物量减少。

3 、底物（ dNTPs ）

dNTPs 溶液应在 -20 ℃ 存放，过多的冻融会使 dNTPs 降解。在 RAPD 反应中， dNTPs 浓

度系在饱和浓度 (200umol/L) 下使用， dNTPs 浓度过高可加快反应速度，同时还可增加碱基的错误掺入率和实验成本，反之，低浓度的 dNTPs 会导致反应速度的下降，但可提高试验的精确性。 4 种 dNTPs 在使用时必须以等当量浓度配制，以减少错配误差和提高使用效率，此外，由于 dNTPs 可能与 Mg² 结合，因此，应注意 Mg² 浓度和 dNTPs 浓度之间的关系。

4 、反应的缓冲液

缓冲液成分： 50 mmol/L KCl 10 mmol/L Tris-HCl （室温下 pH=8 ． 4 ）

1 ． 5mmol/L MgCl₂

缓冲液中能影响反应的特异性和扩增片断的产率，在一般的 PCR 反应中， 1 ． 5~2 ． 0mmol/L 是比较合适的（对应 dNTP 浓度为 200umol/L 左右）， Mg² 过量能增加非特异扩增并影响产率。由于 Mg² 的最佳作用浓度相当低，因此所制备的模板 DNA 中不应含有高浓度的鳌合剂，如 EDTA ，不应含有高浓度的带负电荷的离子基团，如磷酸根。

缓冲液中的 BSA 和明胶对酶起保护作用。 KCl 在 50mmol/L 时能促进引物退火，大于此浓度时将会抑制 TaqDNA 聚合酶的活性。 10~50mmol/L Tris-HCl ， pH8 ． 4 ，起调节 pH 使 TaqDNA 聚合酶的作用环境维持偏碱性。

5 、 RAPD 的循环参数

PCR 扩增是由变性、退火、（复性）和延伸三个步骤反复循环组成的。其中每一步的温度、时间以及循环次数等参数是非常重要的。

⑴、变性

一般选择 94 ℃ ， 30s~1min ，可使各种复杂的 DNA 分子完全变性。应根据模板 DNA 的复杂程度，调整变性温度和时间。对 GC 含量高的 DNA ，应用较高的变性温度和时间。若变性不充分，会影响 PCR 产物的产量，反之若过度变性（温度过高，时间过长）会对 TaqDNA 聚合酶活性和 dNTP 分子造成损坏。 RAPD 反应由于用基因组 DNA ，因此变性时间稍长为 1min 。

⑵、退火

由于 RAPD 的引物短，因此退火温度应比常规 PCR 温度（ 50 ℃ ）低，为 36 ℃ ，温度过高会引起引物从模板上脱落。退火时间也比常规 PCR(30s) 长，为 1min30s ，以利于引物与模板 DNA 的牢固结合。

⑶、延伸

延伸温度应选择在 70~75 ℃ 之间，此时， TaqDNA 聚合酶具最高活力。 RAPD 反应由于引物过短，延伸温度不利过高，否则不利于引物与模板的结合。 RAPD 中可采用使反应温度缓慢升高到 70~75 ℃ 的方法，因为在最初较低温度下， DNA 聚合酶已催化延伸反应开始（ 1 ． 5 个 bp/s ），接下来的较高温度不会对这种延伸过的引物和 DNA 模板的结合发生影响。延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般 1 分钟延伸足以完成 2kb 的序列，扩增片段在 2kb 以上，则需加长延伸时间。 RAPD 反应由于扩增片段的长度是随机的，有可能有 2kb 以上的片段，因此延伸时间比常规 PCR(1min) 长，为 1min30s 。

⑷、循环次数

RAPD 一般为 35~40 个，循环次数的选择主要取决于模板 DNA 的浓度，浓度高，则循环次数可降低，过高的循环次数（＞ 40 次），则会增加非特异性产物的量及其复杂度。

5 、模板

RAPD 反应由于引物序列短，扩增片段随机，因此为获得理想的结果，除模板中不应含有高浓度的 EDTA 和盐离子外，对模板的纯度要求甚高， OD₂₆₀ /OD₂₈₀ 最好在 1 ． 8 ， OD₂₆₀ /OD₂₃₀ ＞ 2 ． 0 ，工作浓度一般为 50~100ng 。

此外，如模板为环状，则应先将其线状化，因闭环 DNA 的扩增效率低。