分子生物学试验方法探讨一－Northern blots 技术

研究RNA的方法有很多种，常用的如核酸保护性分析(NPA)、RT-PCR、Northern blots等等。而Northern blots曾经是应用得最广的技术之一，尽管其分辨率和操作简易性都不如前者，但Northern blots依然是检测、定量mRNA大小及在组织中表达水平的标准方法，既是能直接提供有关RNA完整性、不同的剪接信息及mRNA大小等信息的唯一方法，也是在同一张膜上直接比较同一信息在不同样品中的表达丰度的首选方法。Northern blots的操作步骤相当繁琐，且对RNase污染非常敏感，任一步操作不当都会严重影响分辨率。尽管Northern blots曾经是应用得最广的技术之一，但不同的实验室甚至不同的人往往都会根据自己的条件采用不同的方法。通常我们称《分子克隆》所书的方法为标准方法（Maniatis）。然而优化这个标准方法中的以下几个操作步骤可以使其灵敏度提高10-20倍：探针的选择、膜的选择和转移方法、杂交液的选择、甲醛还是乙二醛的选择、试剂的质量。以下从这些方面分别加以讨论。

探针的选择
Northern blots探针的来源有多样性，可以是cDNA、PCR产物、寡核苷酸，也可以是RNA探针。由于双链探针中的反义链与RNA结合后，存在另一链的竞争性抑制，而RNA探针则不存在这个问题；另外RNA: RNA结合物热稳定性很高，RNA探针杂交要求更高的杂交温度(68度)和更严谨的洗膜条件，使背景降低；且合成RNA探针的DNA模版可以经DNase消化处理，不会干扰杂交，这些因素使得选用RNA探针比DNA探针的灵敏度提高10倍以上。同样理由，单链DNA探针又比Random Primed的双链探针要好。

膜的选择
由于硝酸纤维素膜通常不能耐受2轮以上的杂交和洗膜操作，而带正电的尼龙膜对RNA的结合力强且能从容耐受多轮杂交而信号并不减弱，处理大张膜时又不必担心撕裂或卷曲，因而成为首选。带正电的尼龙膜的唯一缺点是背景较高，特别是使用RNA探针时。

样品的选择
由于膜的载量有限，Northern blots的上样量因而受限，提高分辨率的方法之一是用mRNA代替总RNA电泳以提高mRNA的总量，而选用带更高电荷的尼龙膜得到更大的结合容量也有类似的作用。

转移方法
转移的方法有多种，真空转移因为快速高效而成为首选。没有条件做真空转移的可以选择毛细管转移或电转移。传统方法为上行毛细管转移，即吸水纸在胶、膜的上方，需4-18小时。Ambion公司推出的NorthernMax Kir提供了一种下行毛细管转移法，即吸水纸在胶、膜的下方，配合它的转移缓冲液可加快RNA，特别是大分子RNA的转移，使RNA转移得更完全，分辨率提高，且转移过程可缩短至１小时。

由于将核酸通过电转移到硝酸纤维素膜上要求很高的离子浓度，导致电流太大，需要大体积的缓冲液以保证缓冲容量不因电解而耗尽和大体积的冷却系统，因而这一方法较少使用。而核酸能在低离子强度下电转移固定在尼龙膜上，这也是尼龙膜优于硝酸纤维素膜的另一原因。

杂交液的选择
杂交液的选择直接影响信噪比、非特异性背景的高低。杂交液中应含有与探针匹配的阻断剂。许多杂交液只含有DNA阻断剂，当要做RNA探针杂交时必须加入变性的酵母总RNA或其它RNA阻断剂。另外杂交液应经过严格过滤以除去可能引致斑点背景的不溶物和小颗粒。当然它必须是无DNAse及RNAse的。

甲醛vs.乙二醛？
在含有甲醛的变性胶中进行RNA电泳是较常见的方法。相比之下，乙二醛／DMSO方法无须制备甲醛变性琼脂糖凝胶，无须通风橱等安全设备，只需将样品用乙二醛／DMSO预处理变性，在普通胶上电泳即可。但由于泳动速度慢而往往需要将电泳液循环以避免形成过高的氢离子梯度。