植物抗虫基因工程的研究进展

李海燕，朱延明，马凤鸣

( 东北农业大学 黑龙江 哈尔滨 150030)

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摘要 概述了目前应用于植物抗虫基因工程的两类主要基因，即苏云金杆菌毒蛋白基因和蛋白酶抑制剂基因的分类、杀虫机理以及基因改造后应用于抗虫基因工程的研究近况，同时探讨了抗虫基因工程存在问题及解决途径，提出了今后可能的发展方向。

0 、前言

虫害是制约农作物高产的重要因素，世界每年因虫害造成的损失约占农作物总产量的 15% 以上。化学农药的施用在减少虫害的同时引起一系列副作用，如提高成本、污染环境、诱导害虫产生抗药性、引起次要害虫的大发生等。而通过基因工程手段培育抗虫新品种 ( 系 ) 可从根本上解决问题，对哺乳动物和一些有益昆虫不产生毒害作用，且不造成环境污染，具有广阔的应用前景。目前全世界最常改良的性状中抗虫占第二位 (24%) ，到 1998 年已商业化的 6 类性状中抗虫占 15% ，抗虫和抗除草剂占 10% 。人们已从细菌中、植物本身以及昆虫体内发现并分离到许多抗虫基因，有许多抗虫转基因植物正在进行田间试验，并有一些品种已商品化。迄今发现并应用于提高植物抗虫性的基因主要有两类 : 一类是从细菌中分离出来的抗虫基因，如苏云金杆菌毒蛋白基因 (Bt 基因 ) 、异戊基转移酶基因 (ipt) ，另一类是从植物中分离出来的抗虫基因，如蛋白酶抑制剂基因 (PI 基因 ) 、淀粉酶抑制剂基因、外源凝集素基因等。其中 Bt 基因和 PI 基因在农业上利用最广，本文对这两类基因的转基因工程研究作一简要综述。

1 、 Bt 毒蛋白基因

1 ． l Bt 毒蛋白的杀虫机理

　　Bt 是苏云金杆菌 Baciius thuringiensis 的简称，是一种革兰氏阳性土壤芽胞杆菌。通过克隆技术确定 Bt 基因位于 30~150MD 大小不同的质粒上，其中毒性区间位于该序列 N 端 29~607 个编码区， C 端有高度的保守性，对稳定晶体蛋白结构可能起着重要作用。 Bt 杀虫活性源于芽胞形成时产生的杀虫结晶蛋白 (insecticidal crystal protein ， ICP) 或苏云金杆菌毒蛋白 (Bt toxic protein) ，其中应用于农业生产的主要是 δ 内毒素。已知 δ 内毒素为 130~160KD 的多肽，在伴孢晶体内是以原毒素 (protoxin) 的形式存在，经体外碱解或在昆虫肠道内被蛋白酶水解成 55~70KD 或更小的多肽，与敏感昆虫中肠道上皮纹缘细胞 (brushborder membrance) 上的特异受体位点结合，引起并破坏纹缘膜细胞渗透压平衡，使细胞裂解，杀死昆虫。

1 ． 2 Bt 霉蛋白基因分类

自 1901 年发现苏云金杆菌以来，现已分离出 4 万多个 Bt 菌种，报道了 51 个血清型， 50 多个亚种，已克隆出 60 多个毒素基因。不同基因型杀虫谱不同，毒蛋白的大小及形状也不一样。根据杀虫谱的不同，将杀虫基因分成六大类，统称为 cry 基因，用罗马数字 I 、 II 、 III 、 IV 等来命名，分别代表几种杀虫范围。在每一类型下根据氨基酸序列的同源性，又分为 A ， B ， C 等不同的基因型。在同一基因型下根据限制性内切酶的酶谱和分子量的大小，又分为 a ， b ， c 等不同的基因亚型。其分类如下 :

cry I 基因型编码对鳞翅目昆虫有毒杀作用的菱形伴孢晶体蛋白，约 30~140KD ，在昆虫中肠内降解为 60~70KD 的多肽，在 cry I 基因间，氨基酸同源性为 82%~90% 的归为 cry I A;55%~71% 的归为 cry I A 基因中，根据限制性内切酶的酶谱和分子量的大小，又分为 :cry I A (a) ， 4.50kb;cry I A (b) ， 5.30kb;cry I A (c) ， 6.60kb 亚类基因。 Cry II 基因通常编码对鳞翅目和双翅目昆虫有毒杀作用的立方体伴孢晶体蛋白，约 65KD 。而 cry II B 只对鳞翅目昆虫有毒性，它们之间的同源性达 80% 左右。 cry III 基因编码对鞘翅目昆虫有特异毒杀作用的长方形伴孢晶体，约 72KD 。 Cry III A 基因与 cry I 和 cryIV 基因的毒性核心 5' 端编码区有同源性，与 3' 端编码区有所不同，如果将 3' 端去掉，将失去杀虫活性。 Cry IV 基因编码对双翅

目昆虫有特异毒性的椭园形伴孢晶体。 cry IV A ， 135KD;cry IV B ， 128KD;cry IV C ， 78KD;cry IV D ， 72KD ， cry IV A 和 cry IV B 基因在结构上与 cry I 相似，毒性核心区段为 53~78KD ，位于原毒素蛋白的 N 端。

1 ． 3 Bt 毒蛋白基因的修饰、改造及应用

虽然早期的转抗虫基因植物或多或少都对昆虫有些抗性，但杀虫蛋白在植株上的表达量很低 ( 占全部可溶性蛋白的 0.001% 以下 ) ，抗虫效果不理想。其主要原因是目前使用的杀虫晶体蛋白大多来源于细菌，与高等植物结构基因正常的 DNA 序列相比， Bt 基因含有较多的 AT 碱基和 ATTTA 重复序列。 AT 富含区在高等植物中被认为是不能表达的内含子， ATTTA 重复序列的 mRNA 的稳定性差，二者都不能在高等植物中编码。此外， Bt 基因中的偏爱密码子与植物中的不同，以及共中存在的一些不稳定元件如 poly(A) 信号序列、切割序列、终止序列等都直接影响着 Bt 基因在植物中的 mRNA 特性。为此， Monsanto 公司从两条途径对原基因进行了改造。

第一条途径是改进 Ti 质粒转化载体的启动子，加入带有 SV40 复制增强子区的 35S 启动子或重复的强化表达区 (duplicated enhanced region) ，发现改建后的载体表达量比原先提高了 5~10 倍 (Perlak 等， 1990) 。

第二条途径是根据植物偏爱的密码子对野生型 (WT)Bt 基因 cry I A(b) 进行部分改造或人工全合成， Perlak 等对 WT cryIA(b)AT 富含区进行点突变，改变其中 63 个碱基对， AT 含量由 63% 下降至 59% ，而 ATTTA 重复序列也从 13 个减少至 7 个，部分改造后的基因称为 PMcryIA(b) 。 PMcryIA(b) 基因在转化的烟草和番茄中的表达量为 1~l0ng/50ug 植物可溶总蛋白，比 WTcryIA(b) 在转基因植物中的表达量 (<1ng/50ug) 提高了 10 倍。进一步在不改变编码的氨基酸序列的前提下，几乎更换掉 WT 基因中的所有不稳定元件，同时尽可能将其中的密码子换成植物优化密码子， AT 含量下降至 51% ，去掉所有 ATTTA 序列。全合成的基因称为 Fncry I A(b) 用其转化烟草 番茄， 10% 以上的转化植株表达量达 30-100n/50ug 植物可溶总蛋白，最高的可达 100 － 150ng/50ug ，比 WtcryIA(b) 的表达量提高 50 － 100 倍，表现较强的杀虫效果。

近年来人们在Ｂ t 毒蛋白基因的修饰与改造、表达载体的构建、植物组织化、抗虫植物的培育等方面作了大量工作（ Krattiger,1997 ）。我国也从 1991 年起开始了Ｂ t cry I A 杀虫基因的部分改造或全合成，并导入棉花、烟草、甘蓝等 25 种以上植物获得成功。目前全世界已获得 50 多种不同的抗虫转基因植物，技术趋向成熟，成果向商品化、实用化阶段深入，并开展大规模的田间推广试验。从 1995 年起， cry I A 类转基因玉米、棉花和马铃薯已商品化，性状有单基因的抗玉米螟、抗棉铃虫和抗马铃薯甲虫，还有玉米和棉花的多基因抗虫＋抗除草剂必状（表 1 ）。

表 1 转 Bt 基因植物

工程植物 Engineering plants	目的基因 Target gene	转化方法 Transformation method	参考文献 Reference
烟草 Tobacco	Cry I A(a) （抗烟草天蛾） Cry I A(b) （抗烟草天蛾） Cry I A(c) （抗烟草青虫） Bt( 获纯合体株系Ｄ 8 -14 ，Ｄ 19 -8) Cry I A(b) （切去 3’ 端，留 640 序列）	农杆菌介导 农杆菌介导 农杆菌介导 农杆菌介导 农杆菌介导	Barton 等 1987 Vacek 等 1987 田颖川等 1991 李太元等 1994 Fischhott 等 1987
番茄 Tomato	Cry I A(b)( 抗口科鳞翅目 ) Bt （抗番茄果虫，番茄蠹蛾） Cry I a(b) （减少Ａ＋Ｔ含量） Bt CMV-CP	农杆菌介导 农杆菌介导 农杆菌介导 农杆菌介导	Delannay 等 1989 Smith 等 1990 Perlak 等 1991 梁小友等 1994
马铃薯 Potato	Cry III A CryIII A Cry I A(c)	农杆菌介导 农杆菌介导 农杆菌介导	Cheng 等 1992 Oerlak 1993 Ebora 1994
棉花 Cotton	Bt( 转原生质体 ) Bt （下胚轴 NPT II Kan’） Bt	农杆菌介导 农杆菌介导 农杆菌介导	El-Hiateny 等 1990 Umbeck 等 1991 Benedict 等 1992
粳稻 Japonica rice	Cry I A ( 抗稻纵叶卷螟 )	电击法（原生质体）	Fujimoto 等 1993
水稻 Rice	Bt Cry I A(b) （未见抗虫性报道） Cry I A(b) Cry I A(b) Cry I A(c)	ＰＥＧ法（ＰＢＩ 121 ） 花粉管通道法 基因枪法（胚性愈伤） 农杆菌介导	杨虹等 1989 谢道昕等 1991 许新萍等 1997 成雄鹰 1998
籼稻 Indica rice	Cry I A(b)	基因枪法	Wunnj 等 1996
籼稻和粳稻 Indica and Japonica rice	Cry I A(b) （三化螟）	基因枪法	Datta 等 1998
玉米 Maize	Cry I A(b) Bt 、 bar Bt Bt	基因枪法 子房注射 超声波 基因枪法	Koziel 等 1993 丁群星等 1993 张宏等 1993 王国英等 1993
大豆 Soybean	Bt （未见杀虫效果报道） Bt	农杆菌介导（ LBA4404 ） 侵染子叶节	Parrott 等 1994 徐香玲等 1997
苹果 Apple	Bt	农杆菌介导	程家胜等 1994
甘蔗 Sugarcane	Cry I A(c) （抗非洲蔗螟）	农杆菌介导	Fitch 等 1996

2 、蛋白酶抑制剂基因（ PI 基因）

PI 是自然界最为丰富的蛋白质之一，存在于绝大多数生物体尤其是许多植物的贮藏器官，如种子和块茎中，是一类天然的抗虫物质，与前述苏云金杆菌相比，具有抗虫谱广、对人畜无副作用及昆虫不易产生耐受性等优点（ Gatehouse,1988 ）。在植物界，现已发现近 10 个蛋白酶抑制剂家族，与抗虫基因工程关系最密切、研究最深入的是丝氨酸蛋白酶抑制剂，基中最主要的是胰蛋白酶抑制剂。因为绝大多数昆虫所利用的正是这一类消化酶，而植物细胞基本没有这种酶，或含量甚微。 PI 同昆虫消化道内的蛋白消化酶形成复合物，阻断或削弱蛋白酶的水解形成复合物，阻断或削弱蛋白酶的水解作用，使昆虫厌食或消化不良致死，从而达到抗虫目的。

目前已从豇豆、马铃薯、番茄、大豆、玉米等植物中分离纯化出多种蛋白酶抑制剂基因或 cDNA 克隆。主要有豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（ CpTI 基因）、马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因（ PTI 基因）、玉米半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因（ CPI 基因）以及大豆 Kunitz 型胰蛋白酶抑制剂基因（ SKTI 基因）等。比较不同来源的各种蛋白酶抑制剂，发现 CpTI 抗虫效果较为理想，其抗虫范围广，对鳞翅目、鞘翅目、直翅目等几乎所有昆虫都有杀伤作用，而且其作用位点在酶的活性中心，突变的可能性小，昆虫产生抗性突变的可能性几乎没有，目前已应用于抗虫烟草、水稻、大豆，但由于其表达能力不够强，应用暂时受到限制。 1997 年高越峰、朱祯等人从未成熟的大豆子叶中分离出 SKTI 基因，为多基因家族，可抑制不同来源的胰蛋白酶活性，尤其对鳞翅目昆虫有较强抑制作用，且 SKTI 对胰蛋白酶活性的抑制能力明显高于 CpTI ，显示出较好的应用前景。表 2 列出蛋白酶抑制剂基因主要应用实例。

表 2 转蛋白酶抑制剂基因植物

工程植物 Engineering plants	目的基因 Target gene	转化方法 Transformation method	参考文献 Reference
烟草 Tobacco 水稻 Rice	CpTI PTI CpTI SKTI （抗棉铃虫） CpTI （抗二化螟、三化螟） CPI （抗线虫） CPI （抗玉米象）	农杆菌介导 农杆菌介导 农杆菌介导 农杆菌介导 直接转化 基因枪法 基因枪法	Hilder 等 1987 Thornburg 等 1987 刘春明等 1992 高越峰等 1998 莽克强等 1993 Vain 等 1994 Kentaro 等 1996

3 、抗虫基因工程潜在的问题、解决途径及展望

伴随抗虫基因工程进展，其在应用方面潜在的问题也日益显露。

首先是昆虫对 Bt 毒蛋白产生抗性的问题。原因之一：根据 Bt 毒蛋白的杀虫机理，在长期选择压力下，昆虫纹缘膜细胞上的受体位点会发生改变，使晶体蛋白不能与纹缘膜细胞上的受体位点结合，失去毒杀作用，结果昆虫就产生抗生。为此，可以采取以下策略， (1) 将不同杀虫机理的杀虫蛋白基因 ; 如具有广谱抗虫特点的 CpTI 基因以及其他多肽毒素基因结合 Bt 基因转化植物来抑制昆虫产生抗性。 (2) 采用诱导型或组织特异性表达的启动子与 Bt 毒蛋白基因构成嵌合基因，获得特异性表达的抗虫品种。使 Bt 基因只在害虫侵害时或者只在植物易受害虫侵害的部位或者只在一定的条件下 ( 如化学调节剂 ) 高效表达，以减少耐受性昆虫 的发展。 (3) 把高剂量表达的转基因植物与非转基因植物混合播种，使在 Bt 植株上具有纯合抗性基因的抗性昆虫与非转基因植物内易感昆虫交配，它们的后代成为杂合体，这样可以去除昆虫产生的抗性基因，防止抗性等位基因在昆虫群体中固定。原因之二： Bt 毒蛋白的抗虫谱较窄，某一特定的毒蛋白只对某一种或几种害虫具有毒杀作用，害虫易对其产生抗性。对此可同时使用两个以上的 Bt 毒蛋白基因转化植物。不同的 Bt 毒蛋白，根据与竺定昆虫中肠纹缘膜细胞不同受体位点的结合程度，分为竞争性结合 (competitively binding) 和非竞争性结合 (noncompetitively binding) 蛋白，如果两种晶体蛋白竞争结合昆虫中肠全部受体位点，就称为竞争性结合毒蛋白 ; 如果与第一种毒蛋白结合的受体中有一个或多个不为第二种蛋白所竞争，反之亦然，那么，对该昆虫来说，这两上毒蛋白都是非竞争的。将编码非竞争性结合毒蛋白的 2 个或 2 个以上基因同时导入植物，能在很大程度上延缓害虫所产生的抗性。

第二个问题是目前 Bt 毒蛋白基因在转基因植物体中的表达水平普遍较低，存在基因“沉默”和甲基化现象，不能有效地毒杀害虫。基因沉默与目的基因在受体植物中的甲基化状况、拷贝数、插入受体染色体位点及是否与受体植物中有同源基因等因素有关。目前主要采取以下措施来克服基因沉默现象； (1) 避免多拷贝外源基因整合到受体基因组中，如利用 Ac/Ds 转化载体、双元细菌人造染色体载体、构建核基质支架附着区载体系统。 (2) 用具有特殊功能的启动子与增强子调控。 (3) 在有性世代后代中筛选单拷贝转基因个体。（ 4 ）继续深入研究 DNA 的空间结构以及各种调控因子和环境因子对转基因的影响。 Jaquet 等分析至少有三种因素影响杀虫活性 : 毒素的来源、晶体的溶解性和昆虫对毒素的内在敏感性，昆虫对毒素的 内在敏感性至少还与中肠液 pH 、蛋白酶活性和毒素受体的类型、数量有关。 Bt 毒蛋白有 134 个亚类，它们一级结构的差异以及昆虫中肠上皮细胞上的受体是影响杀虫晶体蛋白毒力和杀虫特异性的两个重要因素。随着转基因沉默机理研究的不断深入，这种现象最终必将会得到克服。

抗虫植物基因工程是一项应用性极强的研究，它使短时间内培育出抗虫品种成为可能。同时正在进行田间试验的性状中，多基因抗虫性状也屡次出现，将 Bt 基因、特殊的抗病基因、抗除草剂基因及优良品质基因集聚于同一品种。相信不久的将来，会有越来越多的多基因抗虫品种问世。

 

 

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