免疫胶体金(Immune colloidal gold)
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原理
免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（ HAuCl4 ）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。
胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如 SPA 、 PHA 、 ConA 等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
胶体金的制备
根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。常用来制备胶体金颗粒的方法如下。
1 ．枸橼酸三钠还原法
（ 1 ） 10nm 胶体金粒的制备：取 0.01 ％ HAuCl4 水溶液 100ml ，加入 1 ％枸橼酸三钠水溶液 3ml ，加热煮沸 30min ，冷却至 4 ℃ ，溶液呈红色。
（ 2 ） 15nm 胶体金颗粒的制备：取 0.01 ％ HAuCl4 水溶液 100ml ，加入 1 ％枸橼酸三钠水溶液 2ml ，加热煮沸 15min ～ 30min ，直至颜色变红。冷却后加入 0.1Mol/L K2 CO3 0.5ml ，混匀即可。
（ 3 ） 15nm 、 18nm ～ 20nm 、 30nm 或 50nm 胶体金颗粒的制备：取 0.01 ％ HAuCl4 水溶液 100ml ，加热煮沸。根据需要迅速加入 1 ％枸橼酸三钠水溶液 4ml 、 2.5ml 、 1ml 或 0.75ml ，继续煮沸约 5min ，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为 15nm 、 18 ～ 20nm 、 30nm 和 50nm 。
2 ．鞣酸—枸橼酸钠还原法
A 液： 1 ％ HAuCl4 水溶液 1ml 加入 79ml 双馏水中混匀。
B 液： 1 ％枸橼酸三钠 4ml ， 1 ％鞣酸 0.7ml ， 0.1Mol/L K2 CO3 液 0.2ml ，混合，加入双馏水至 20ml 。
将 A 液、 B 液分别加热至 60 ℃ ，在电磁搅拌下迅速将 B 液加入 A 液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为 5nm 。如需要制备其它直径的金颗粒，则按表所列的数字调整鞣酸及 K2 CO3 的用量。
鞣酸—枸橼酸钠还原法试剂配制表
|
金粒直径 （ nm ） |
A 液 |
B 液 |
||||
|
1 ％ HAuCl4 |
双馏水 |
1 ％枸橼酸三钠 |
0.1Mol/L K2 CO3 |
1 ％鞣酸 |
双馏水 |
|
|
5 |
1 |
79 |
4 |
0.20 |
0.70 |
15.10 |
|
10 |
1 |
79 |
4 |
0.025 |
0.10 |
15.875 |
|
15 |
1 |
79 |
4 |
0.0025 |
0.01 |
15.9875 |
3 ．制备高质量胶体金的注意事项
（ 1 ）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。
（ 2 ）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜（ 0.45 µ m ）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。
（ 3 ）配制胶体金溶液的 pH 以中性（ pH7.2 ）较好。
（ 4 ）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好是进口的。
（ 5 ）氯金酸配成 1 ％水溶液在 4 ℃ 可保持数月稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，最好将整个小包装一次性溶解。
胶体金标记蛋白的制备
胶体金对蛋白的吸附主要取决于 pH 值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的 pH 值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。
1 ．待标记蛋白溶液的制备 将待标记蛋白预先对 0.005Mol/L pH7.0 NaCl 溶液中 4 ℃ 透析过夜，以除去多余的盐离子，然后 100 000g 4 ℃ 离心 1h ，去除聚合物。
2 ．待标胶体金溶液的准备 以 0.1Mol/L K2 CO3 或 0.1Mol/L HCl 调胶体金液的 pH 值。标记 IgG 时，调至 9.0 ；标记 McAb 时 , 调至 8.2 ；标记亲和层析抗体时，调至 7.6 ；标记 SPA 时，调至 5.9 ～ 6.2 ；标记 ConA 时，调至 8.0 ；标记亲和素时，调至 9 ～ 10 。
由于胶体金溶液可能损坏 pH 计的电板，因此，在调节 pH 时，采用精密 pH 试纸测定为宜。
3 ．胶体金与标记蛋白用量之比的确定
（ 1 ）根据待标记蛋白的要求，将胶体金调好 pH 之后，分装 10 管，每管 1ml 。
（ 2 ）将标记蛋白（以 IgG 为例）以 0.005Mol/L pH9.0 硼酸盐缓冲液做系列稀释为 5 µ g/ml ～ 50 µ g/ml ，分别取 1ml ，加入上列金胶溶液中，混匀。对照管只加 1ml 稀释液。
（ 3 ） 5min 后，在上述各管中加入 0.1ml 10 ％ NaCl 溶液，混匀后静置 2h ，观察结果。
（ 4 ）结果观察，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定 1ml 胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加 10 ％～ 20 ％。
4 ．胶体金与蛋白质（ IgG ）的结合 将胶体金和 IgG 溶液分别以 0.1Mol/L K2 CO3 调 pH 至 9.0 ，电磁搅拌 IgG 溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌 10min ，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。常用稳定剂是 5 ％胎牛血清（ BSA ）和 1 ％聚乙二醇（分子量 20KD ）。加入的量： 5 ％ BSA 使溶液终浓度为 1 ％； 1 ％聚乙二醇加至总溶液的 1 ／ 10 。
5 ．胶体金标记蛋白的纯化
（ 1 ）超速离心法：根据胶体金颗粒的大小，标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。
用 BSA 做稳定剂的胶体金—羊抗兔 IgG 结合物可先低速离心（ 20nm 金胶粒用 1 200r/min ， 5nm 金胶粒用 1 800r/min ） 20min ，弃去凝聚的沉淀。然后将 5nm 胶体金结合物用 6 000g ， 4 ℃ 离心 1h ； 20nm ～ 40nm 胶体金结合物， 14 000g ， 4 ℃ 离心 1h 。仔细吸出上清，沉淀物用含 1 ％ BSA 的 PB 液（含 0.02 ％ NaN3 ），将沉淀重悬为原体积的 1 ／ 10 ， 4 ℃ 保存。如在结合物内加 50 ％甘油可贮存于 -18 ℃ 保存一年以上。
为了得到颗粒均一的免疫金试剂，可将上述初步纯化的结合物再进一步用 10 ％～ 30 ％蔗糖或甘油进行密度梯度离心 , 分带收集不同梯度的胶体金与蛋白的结合物。
（ 2 ）凝胶过滤法：此法只适用于以 BSA 作稳定剂的胶体金蛋白结合物的纯化。将胶体金蛋白结合物装入透析袋，在硅胶中脱水浓缩至原体积的 1 ／ 5 ～ 1 ／ 10 。再经 1 500r/min 离心 20min 。取上清加至 Sephacryl S-400 （丙烯葡聚糖凝胶 S-400 ）层析柱分别纯化。层析柱为 0.8 cm × 20cm ，加样量为床体积的 1 ／ 10 ，以 0.02Mol/L PBS 液洗脱（内含 0.1 ％ BSA ， 0.05 ％ NaN3 ， pH8.2 者用 IgG 标记物），流速为 8ml/h 。按红色深浅分管收集洗脱液。一般先滤出的液体为微黄色，有时略混浊，内含大颗粒聚合物等杂质。继之为纯化的胶体金蛋白结合物，随浓度的增加而红色逐渐加深，清亮透明，最后洗脱出略带黄色的为标记的蛋白组分。将纯化的胶体金蛋白结合物过滤除菌、分装 , 4 ℃ 保存。最终可得到 70 ％～ 80 ％的产量。
6 ．胶体金蛋白结合物的质量鉴定
（ 1 ）胶体金颗粒平均直径的测量：用支持膜的镍网（铜网也可）蘸取金标蛋白试剂，自然干燥后直接在透射电镜下观察。或用醋酸铀复染后观察。计算 100 个金颗粒的平均直径。
（ 2 ）胶体金溶液的 OD520 nm 值测定：胶体金颗粒在波长 510nm ～ 550nm 之间出现最大吸收值峰。用 0.02Mol/L pH8.2 PBS 液（含 1 ％ BSA ， 0.02 ％ NaN3 ）将胶体金蛋白试剂作 1 ︰ 20 稀释， OD520 ＝ 0.25 左右。一般应用液的 OD520 应为 0.2 ～ 0.4 。
（ 3 ）金标记蛋白的特异性与敏感性测定：采用微孔滤膜免疫金银染色法（ MF － IGSSA ）。将可溶性抗原（或抗体）吸附于载体上（滤纸、硝酸纤维膜、微孔滤膜），用胶体金标记的抗体（或抗原）以直接或间接染色法并经银显影来检测相应的抗原或抗体，对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴定。
