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免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)

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(一) 原理
免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原 抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下,聚合成为特定大小的金颗粒,并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态,称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷,可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合,由于这种结合是静电结合,所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外,还可以与许多其它生物大分子结合,如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状,如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应,加上结合物的免疫和生物学特性,因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
(二) 胶体金的制备
根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。常用来制备胶体金颗粒的方法如下。
1.枸橼酸三钠还原法 (1)10nm胶体金粒的制备:取0.01%HAuCl4水溶液100ml,加入1%枸橼酸三钠水溶液3ml,加热煮沸30min,冷却至4℃,溶液呈红色。(2)15nm胶体金颗粒的制备:取0.01%HAuCl4水溶液100ml,加入1%枸橼酸三钠水溶液2ml,加热煮沸15min~30min,直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml,混匀即可。(3)15nm、18nm~20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备:取0.01%HAuCl4水溶液100ml,加热煮沸。根据需要迅速加入1%枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml,继续煮沸约5min,出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18~20nm、30nm和50nm。
2.鞣酸—枸橼酸钠还原法A液:1%HAuCl4水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。B液:1%枸橼酸三钠4ml,1%鞣酸0.7ml,0.1Mol/L K2CO3液0.2ml,混合,加入双馏水至20ml。将A液、B液分别加热至60℃,在电磁搅拌下迅速将B液加入A液中,溶液变蓝,继续加热搅拌至溶液变成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为5nm。如需要制备其它直径的金颗粒,则按表15-1所列的数字调整鞣酸及K2CO3的用量。表15-1鞣酸—枸橼酸钠还原法试剂配制表金粒直径(nm)A液B液1%HAuCl4双馏水1%枸橼酸三钠0.1Mol/L K2CO31%鞣酸双馏水517940.200.7015.101017940.0250.1015.8751517940.00250.0115.98753.制备高质量胶体

金的注意事项(1)玻璃器皿必须彻底清洗,最好是经过硅化处理的玻璃器皿,或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿,再用双馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子 与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性,不能获得预期大小的金颗粒。
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