酶标记方法
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交联法
交联法通常用的交联剂是戊二醛，戊二醛商品大多为 25% 的水溶液，利用戊二醛分子上对称的两个醛基，分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。标记时应尽量采用新鲜纯品，当戌二醛的 OD235 nm/OD280 nm ＜ 3 时，即为好的交联剂。
戊二醛交联法又分为一步法和二步法。
⑴ 一步法：即把酶、戊二醛和抗体一起加入进行交联。然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物。由于抗体分子量大 (16 万 ) ，酶分子量小 (4 万 ), 抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多，结果生成的抗体－戊二醛或抗体－戊二醛－抗体多而造成酶标物的活性小。一步法操作：①抗 IgG － AKP 的制备：将 10mgAKP 溶于含有 5mg 抗 IgG 的 1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0) 中，在冰浴中缓缓搅拌，尽量避免气泡产生，完全溶解后，缓缓滴加 1% 戊二醛溶液 4ml ，使戊二醛的最终浓度为 0.2% ，移至室温中静置 2h~3h 后，以 0.01Mol/L pH7.0 PBS 液 4 ℃ 充分透析或以 SephadexG25 柱除去过量的戊二醛， 4 ℃ 保存备用 ( 也可保存于 50% 甘油中置低温冰箱 ) ；②抗 IgG － HRP 的制备：将 12mgHRP 溶于含 5mg 抗 IgG 的 1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8) 中 , 缓慢搅拌下加入 1% 戊二醛溶液 4mL ，置室温 2h~3h ，充分透析或以 SephadexG25 除戊二醛，小量分装后保存于低温冰箱，避免反复冻融。或冷冻干燥保存。
⑵ 二步法：是先使酶与戊二醛反应 , 除去未反应的戊二醛，再使已“活化”的酶分子与抗体分子的氨基结合，最后加入少量的赖氨酸封闭被戊二醛激活的酶的残基。二步法操作：将 10mg 的酶溶于 0.2ml 含 1.25% 戊二醛的 0.1mol/L pH6.8 PBS 中室温放置 18h ，充分透析或以 SephadexG25 柱除去未反应的戊二醛。加生理盐水至 1ml 然后加入 1ml( 含 5mg) 的抗体溶液和 1ml 1Mol/L pH9.6 碳酸盐缓冲液，混合后 4 ℃ 冰箱放置 24h ，加入 0.1ml 0.2mol/L 赖氨酸，置室温 2h ，以 0.15Mol/L pH7.2 PBS 液充分透析，离心去沉淀，上清液即为酶结合物，再进一步以硫酸铵沉淀纯化后应用。 AKP 一般不采用二步法 , 而只用一步法。
改良 HRP 二步标记法：取 HRP10mg 溶于 0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS 液中或 0.05Mol/L pH9.6 碳酸盐缓冲液中，加入 25% 戊二醛 0.1ml ， 37 ℃ 温育 2h 后加入冰冷的分析纯的无水乙醇 2ml ， 2 500r/min 离心沉淀 10min~15min ，倾去溶液。沉淀以 80% 乙醇 4ml~5ml 混悬，同上离心，倾去乙醇，将管倒置，使乙醇充分流出。沉淀用 1ml 0.05Mol/L pH9.6 碳酸盐缓冲液溶解，加入 0.5ml~1ml 抗 IgG 抗体溶液 ( 含抗体 15mg 左右 ) ，放在冰箱内过夜后，加 KH2 PO4 ，使近中性即可应用。
氧化法
采用过碘酸钠，过碘酸钠是强氧化剂，能将 HRP 的甘露糖部分 ( 与酶活性无关的部分 ) 的羟基氧化成醛基，然后与抗体的氨基结合 , 形成酶标抗体。
（ 1 ）氧化法操作过程如下：将 5mgHRP 溶于新配制的 1ml 0.30Mol/LpH8.1 重碳酸钠中，加 0.1 ml 1% 氟二硝基苯 (FDNB) 无水乙醇溶液 , 在室温中混合后，再加入 1ml 0.04Mol/L~0.08Mol/L 过碘酸钠 (NaIO4 ) ，置室温中轻搅 30min ，在溶液呈黄绿色时，加 1ml 0.16Mol/L 乙二醇溶液，在室温中放置 1h ，使氧化反应中止，然后在 4 ℃ 中对 0.10Mol/L pH 9.5 重碳酸钠缓冲液透析，换液 3 次。在 3ml HRP －醛基溶液中，加入 5mg( 溶于 1ml 的碳酸盐缓冲液中 ) ，室温置 2h~3h ，加入 5mg 氢化硼钠 (NaBH4 ) ，于 4 ℃ 冰箱放置 3h 或过夜，然后用 PBS 液充分透析，离心去沉淀物。上清液即为酶结合物，纯化后使用。
（ 2 ）改良过碘酸钠法：①取 5mg HRP 溶于 0.5ml 双馏水中，加入新配制的 0.06Mol/L NaIO4 水溶液 (10ml 双馏水＋ 128mg NaIO4 ) 0.5ml ，混匀，置 4 ℃ 30min ；② 取出后加入 0.16Mol/L 乙二醇水溶液 (10mlH2 O 0.09ml 乙二醇 )0.5ml ，室温放置 30min ；③加入含 5mg 纯化抗体的水溶液 1ml ，混匀，并装入透析袋，对 0.05Mol/L pH 9.5 碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析 6h( 或过夜 ) ，使之结合；④加入 NaBH4 溶液 (5mg/ml)0.2ml ，混匀，置 4 ℃ 2h ；⑤在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀， 4 ℃ 30min ，离心，去上清，沉淀以少许 0.02Mol/L pH7.4 PBS 液溶解，装入透析袋，以同样液体在 4 ℃ 透析除盐过夜；⑥次日取出离心，以除去不溶物，即得酶－抗体 (HRP － IgG) 结合物，以 0.02Mol/L pH 7.4 PBS 液加至 5ml ；⑦效价测定合格后，加入等量优质甘油，分装小瓶，低温保存。
戊二醛法与过碘酸钠法比较
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比较项目
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戊二醛法 |
过碘酸钠法
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一步法 |
二步法 |
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标记方法 |
简单 |
较复杂 |
较复杂 |
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酶利用率 |
2 ～ 4% |
2 ～ 4% |
70% 酶偶联到 99% 抗体上 |
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产率 |
＜ 5% |
＜ 5% |
＞ 50% |
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标记抗体分子量 |
750 万 |
＜ 25 万 |
＞ 40 万 |
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穿入组织能力 |
差 |
好 |
一般 |
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抗体活性丢失 |
多 |
少 |
较多 |
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酶活性丢失 |
多 |
少 |
较多 |
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染色效应 |
差 |
较好 |
较好 |
二马来酰亚胺法
二马来酰亚胺 (Dimaleimide) 能与蛋白质半胱氨酸的硫基反应。首先用 α －巯基乙胺还原蛋白质 (IgG), 并用 N 、 N ‘ －Ｏ－苯二马来酰亚胺活化，然后除去多余的试剂，最后使含二马来酰 IgG 与含硫基的 β －半乳糖苷酶连接。具体操作如下：将抗 lgG 抗体溶于 0.1Mol/L pH5.0 醋酸钠缓冲液并对同一缓冲液透析平衡过夜 , 离心除去不溶性物质 , 抗 IgG(14mg/2ml) 与 10ml α －巯基乙胺在 37 ℃ 温育 90min 。过 Sephadex 后浓缩使每 ml 含 3.0mg 左右的还原抗 IgG 。在 0 ℃ 中 , 按 1 ︰ 1 滴加饱和 N 、 、 N ‘ － O －苯二马来酰亚胺溶液，混合，于 30 ℃ 温育 20min ，过 SephadexG25 柱，除去未反应的二马来酰亚胺。收集二马来酰亚胺“活化”的抗 IgG, 浓缩使浓度为 OD280nm =1.0( 光径 1cm ), 取 1ml 溶液加 20 μ l(5mg/ml) β －半乳糖苷酶，置 30 ℃ 20min ，用 0.10Mol/L NaOH 中和后，于 4 ℃ 置 24h~72h ，再过 Sepharose-6B 柱 (1.5 × 40cm ) ，以 pH7.0PBS 洗脱 , 收集酶结合物，加叠氮钠 (NaN3 ) 防腐， 4 ℃ 保存备用。
